HPLC測(cè)定健胃消炎顆粒中芍藥苷的含量

林愛(ài)琴，蔣建霞

（1.江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，江蘇姜堰 225500；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，江蘇南京 210029）

健胃消炎顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第17冊(cè)，由黨參、茯苓、白術(shù)等十二味藥物組成；具有健脾和胃，理氣活血的功效，中醫(yī)臨床用于脾胃不和所致的上腹疼痛、痞滿納差以及慢性胃炎見(jiàn)上述證候者。原標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀、鑒別、檢查項(xiàng)，沒(méi)有含量測(cè)定。筆者對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高，結(jié)合處方組成和制備工藝，選擇芍藥苷作為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 Series高相液相色譜儀；Sartorius BP210S分析天平；Sartorius BS21S分析天平；KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110736-200321）；健胃消炎顆粒（無(wú)糖型批號(hào)：040210-1、05020104、05050502；含糖型批號(hào) 040319-1、05010405、05042703）；缺白芍、赤芍的陰性樣品（江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：luna-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（13∶87）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速 1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：室溫。

2.2 提取方法的選擇

參照文獻(xiàn)用50%甲醇溶液為提取溶劑，以A-提取方式[超聲（頻率 80 kHz,功率 100 W）、加熱回流]、B-提取時(shí)間（40、60 min）和 C-提取次數(shù)（1、2 次）為影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 提取方法的選擇試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of orthogonal test for extracting

由上表結(jié)果可以看出，最佳提取條件為A1B1C2，綜合考慮提取時(shí)間、成本及工作效率，確定本品的提取方法：超聲（頻率80 kHz,功率100 W）提取1次、提取時(shí)間60 min。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對(duì)照品10.08 mg，置50 ml量瓶中，加50%甲醇溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。吸取2.5 ml對(duì)照品貯備液至10 ml量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取適量（無(wú)糖型0.5 g、含糖型2.0 g），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液 50 ml，稱定重量，超聲（頻率 80 kHz,100 W）處理60 min，取出，放至室溫，稱重，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.5 陰性樣品干擾試驗(yàn)

按健胃消炎顆粒處方制備缺白芍、赤芍的陰性對(duì)照顆粒，按照供試品溶液的配制方法制得陰性樣品溶液，在選定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果陰性樣品圖譜在芍藥苷對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置處未檢出色譜峰，表明處方中其他藥物對(duì)芍藥苷的測(cè)定無(wú)干擾，該方法有較好的專屬性。HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.3”項(xiàng)下芍藥苷對(duì)照品溶液適量，用50%甲醇溶液稀釋制成濃度為 10.08、25.20、50.40、100.80、201.60 μg/ml的對(duì)照品溶液，搖勻。分別吸取10 μl，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，結(jié)果表明芍藥苷進(jìn)樣量在0.1008～2.0160 μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。回歸方程為A=1111.1742C-2.6489（r=1.0000）。 見(jiàn)表 2。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液 10 μl，重復(fù)進(jìn)樣 6次，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，RSD為0.40%，結(jié)果表明該法精密度良好。見(jiàn)表3。

2.8 最小檢測(cè)限及最小定量限

取濃度為10.08 μg/ml的芍藥苷對(duì)照品溶液用50%甲醇稀釋，按S/N（信噪比）≈3，確定芍藥苷的最小檢測(cè)限為1.5 ng；按S/N（信噪比）≈10確定芍藥苷的最小定量限為5.0 ng。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=5）Tab.2 Result of inspection on linear relation(n=5)

表3 精密度試驗(yàn)（n=6）Tab.3 Test of precision(n=6)

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別在 0、1、3、6、9、12、24 h 時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab.4 Test of stability

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：05050502）0.5 g（6 份），按照“2.12”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算芍藥苷含量，結(jié)果表明該法重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.11 回收率試驗(yàn)

取健胃消炎顆粒（批號(hào)：05050502）細(xì)粉0.26 g，共6份。精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入芍藥苷對(duì)照品溶液（濃度：0.1271 mg/ml）8、8、10、10、12、12 ml，再分別精密加入 50%甲醇溶液 42、42、40、40、38、38 ml，稱定重量，超聲（頻率80 kHz,100 W）提取60 min，取出，放至室溫，稱重，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果表明該法加樣回收率良好。見(jiàn)表6。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)（n=6）Tab.5 Test of repeatability(n=6)

表6 回收率試驗(yàn)（n=6）Tab.6 Results of recovery test(n=6)

2.12 含量測(cè)定方法

取6批樣品，照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算相應(yīng)健胃消炎顆粒中芍藥苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n=6）Tab.7 Content determination results of samples(%,n=6)

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

參照文獻(xiàn)[1-5]對(duì)乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-磷酸鹽緩沖液等3個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行了比較。結(jié)果該樣品在乙腈-水（13∶87）系統(tǒng)中分離效果理想。

3.2 提取溶劑的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道[1-5]，芍藥苷的提取溶劑有甲醇、含水甲醇及稀乙醇，預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果顯示，與50%甲醇溶液比較，以甲醇溶液、稀乙醇溶液提取，芍藥苷含量測(cè)定結(jié)果偏低，且峰形不理想，有明顯的前延或拖尾現(xiàn)象。由此可見(jiàn)，以50%甲醇溶液作為提取溶劑比較適宜，且在此色譜條件下，芍藥苷與其他成分的分離度較好，柱效較高，保留時(shí)間適中。

3.3 提取條件的優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)超聲提取其芍藥苷含量比經(jīng)回流提取的高出0.1%，表明超聲和回流對(duì)提取率幾乎沒(méi)有影響，考慮到超聲提取簡(jiǎn)單易行，故以超聲為本品的提取方式；提取時(shí)間40 min比60 min高4%，提取2次比1次高2%，綜合以上各因素，確定本品的提取方法為超聲提取1次，提取時(shí)間60 min。為驗(yàn)證本方法的可靠性，又進(jìn)行了提取完全性和加樣回收試驗(yàn)：將超聲提取40 min、1次的濾渣再同法提取一次進(jìn)樣測(cè)定，其結(jié)果含量為0.1408 mg/g，提取率為97.2%，已基本提取完全；加樣回收率為100.59%，再次驗(yàn)證了提取條件的可靠性。

3.4 指標(biāo)性成分的確定

根據(jù)有效成分或指標(biāo)性成分清楚、無(wú)干擾的原則，結(jié)合健胃消炎顆粒的方藥組成及制備工藝，本品可供選擇的測(cè)定藥味有：白芍、赤芍、大黃、丹參，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)顯示，制劑中丹參酮ⅡA的含量極低，丹酚酸B的量也較少且陰性有干擾；大黃的成分相對(duì)清楚，但與本品的功能主治有一定的距離，不適宜作為本品的指標(biāo)性成分；近年來(lái)，關(guān)于芍藥苷的基礎(chǔ)藥學(xué)研究已比較成熟，且在本品中含量高、無(wú)干擾，提取工藝簡(jiǎn)單，柱效高。再結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論，白芍、赤芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，平肝止痛的作用，為健胃消炎顆粒的有效成分之一，故以芍藥苷作為本品的測(cè)定指標(biāo)。關(guān)于芍藥苷屬于白芍、赤芍共有成分的問(wèn)題，在《中國(guó)藥典》收載的中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中也有類(lèi)似情況，如黃連與黃柏測(cè)小檗堿、枳實(shí)與枳殼測(cè)橙皮苷、川芎與當(dāng)歸測(cè)阿魏酸等。

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