反相高效液相色譜法測(cè)定獨(dú)活中蛇床子素與異歐前胡素的含量

鄒繼紅，娜日蘇，楊慧明，劉青妍

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

反相高效液相色譜法測(cè)定獨(dú)活中蛇床子素與異歐前胡素的含量

鄒繼紅，娜日蘇，楊慧明，劉青妍

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

目的：建立測(cè)定獨(dú)活中蛇床子素和異歐前胡素的高效液相色譜法.方法：采用Zorbax C18柱，乙腈-0.1%三乙胺水溶液（75:25）為流動(dòng)相，流速為1mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)308 nm.結(jié)果：蛇床子素的線性范圍為25.6～186.8mg·L-1，回歸方程為Y＝4.352×104X+1.062×102，r＝0.9998，平均加樣回收率為 98.2%，RSD=1.02%；異歐前胡素的線性范圍為1.66～20.4mg·mL-1，回歸方程為Y=5.736×102X+1.122，r=0.9999，平均加樣回收率為98.8%，RSD=1.04%.結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于獨(dú)活中蛇床子素和異歐前胡素的質(zhì)量控制.

反相高效液相色譜法；獨(dú)活；蛇床子素；異歐前胡素；含量測(cè)定

獨(dú)活為傘形科植物重齒當(dāng)歸的干燥根.性味辛、苦，微溫.歸腎、膀胱經(jīng).具有祛風(fēng)，除濕，散寒，止痛之功效，是治療風(fēng)寒濕痹，腰膝酸痛，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，風(fēng)寒頭痛等癥的傳統(tǒng)用藥.獨(dú)活中含有大量的蛇床子素和少量的異歐前胡素，本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地獨(dú)活中的蛇床子素和異歐前胡素含量，通過(guò)比較不同產(chǎn)地獨(dú)活的質(zhì)量，為合理利用該藥用植物資源及評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地獨(dú)活的質(zhì)量提供依據(jù).

1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（配置安捷倫色譜工作站），KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），METTLER AE240電子天平（瑞士梅特勒公司），TG332A型微量分析天平（上海儀器有限公司），PE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），HH-2型恒溫水浴鍋（金壇市新航儀器廠），SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（河南太康教材儀器廠）.

蛇床子素對(duì)照品和異歐前胡素對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純(天津市康科德科技有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水，冰醋酸、乙醚、乙酸乙酯和乙醇均為分析純.

獨(dú)活藥材分別購(gòu)自各地藥材公司.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱溫室溫.流動(dòng)相：乙腈-0.1%三乙胺水溶液（75:25），流速 1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng) 308nm，進(jìn)樣量20μL.

2.2 試驗(yàn)溶液的制備

2.2.1 蛇床子素對(duì)照品溶液

精密稱取蛇床子素對(duì)照品10mg，置25ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得400mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

2.2.2 異歐前胡素對(duì)照品溶液

精密稱取異歐前胡素對(duì)照品3mg，置50ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得60mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

2.2.3 混合對(duì)照品溶液

分別精密吸取5.0ml蛇床子素對(duì)照品溶液和異歐前胡素對(duì)照品溶液，置25ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品溶液.

2.2.4 樣品溶液的制備

稱取獨(dú)活藥材粉末約1.0g，精密稱定，加6倍量體積的甲醇40℃水浴下提取2次，每次2h，合并提取液，減壓回收溶劑，殘?jiān)眉状汲暼芙廪D(zhuǎn)移至50mL的量瓶中，并定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得.

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

理論塔板數(shù)以蛇床子素和異歐前胡素計(jì)算均不低于24000，兩物質(zhì)的色譜峰之間及與相鄰峰之間分離度均大于1.5，對(duì)稱因子均在0.95~1.05之間.將對(duì)照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖，對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1.

圖1 高效液相色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取蛇床子素對(duì)照品溶液0.75，1.0，1.5，3.0，4.5mL置于 10mL量瓶中，以甲醇稀至刻度，各取20μL進(jìn)樣，以蛇床子素峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以蛇床子素濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為 Y＝4.352×104X+1.062×102，r＝0.9998.結(jié)果表明，蛇床子素的濃度在25.6～186.8mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

分別精密吸取異歐前胡素對(duì)照品溶液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0mL置于 10mL量瓶中，以甲醇稀至刻度，各取20μL進(jìn)樣，以異歐前胡素峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以異歐前胡素濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=5.736×102X+1.122，r=0.9999.結(jié)果表明，異歐前胡素的濃度在1.66～20.4mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.4 精密度試驗(yàn)

取1號(hào)藥材樣品粉末1.0g，精密稱定，按樣品溶液的制備方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算蛇床子素和異歐前胡素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.92%和1.14%.

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取12號(hào)藥材樣品粉末1.0g，精密稱定，按樣品溶液的制備方法制備成供試品溶液，放置0，2，4，8，12，24h后，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定.結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，蛇床子素和異歐前胡素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.88%和0.97%.

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取9號(hào)藥材樣品粉末6份，每份1.0g，精密稱定，按樣品溶液的制備方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)得蛇床子素和異歐前胡素含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.28%和1.87%.

2.7 回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量獨(dú)活藥材(9號(hào)藥材樣品)粉末0.5g，分別加入一定量的蛇床子素和異歐前胡素對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件分別測(cè)定.蛇床子素和異歐前胡素的回收率分別為98.2%和98.8%，RSD值分別為1.02%和1.04%.測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1～2.

表1 蛇床子素回收率測(cè)定結(jié)果

表2 異歐前胡素回收率測(cè)定結(jié)果

2.8 樣品的測(cè)定

稱取各編號(hào)下獨(dú)活藥材粉末約1.0g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定.測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.

3 討論

3.1 以分光光度計(jì)掃描蛇床子素和異歐前胡素對(duì)照品溶液，結(jié)果蛇床子素的的最大吸收波長(zhǎng)為321nm，異歐前胡素的最大吸收波長(zhǎng)為308nm，但獨(dú)活中蛇床子素的含量較異歐前胡素大得多，為使異歐前胡素的測(cè)定靈敏度合乎要求，所以選擇在308nm處測(cè)定.

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

3.2 在流動(dòng)相選擇的過(guò)程中，曾經(jīng)嘗試用乙腈-水和甲醇-水作為流動(dòng)相，但蛇床子素和異歐前胡素的峰形不佳，故加入三乙胺進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此采用流動(dòng)相為乙腈-0.1%三乙胺的水溶液=75:25，在此條件下，蛇床子素和異歐前胡素峰形對(duì)稱，且能與其他組分得到良好分離.

3.3 曾經(jīng)使用Kromasil C18柱測(cè)定，但組分保留時(shí)間太短，與前面的組分分不開(kāi)，后改用Zorbax C18柱，保留時(shí)間適中，且能與其他組分得到良好分離.

3.4 樣品的預(yù)處理，曾經(jīng)采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和乙醚等溶劑分別進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇回流提取所得異歐前胡素的含量最高，乙醇回流提取時(shí)所得蛇床子素含量最高，但獨(dú)活藥材中蛇床子素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于異歐前胡素，故本文選擇以甲醇提取.

3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的獨(dú)活藥材中蛇床子素和異歐前胡素含量差異顯著.蛇床子素含量最高的為山西太原產(chǎn)獨(dú)活，與其含量最低的湖北武昌產(chǎn)獨(dú)活中蛇床子素的量相差四倍多；河南產(chǎn)獨(dú)活中異歐前胡素含量卻為這13個(gè)產(chǎn)地中最低的，與其含量最高的甘肅蘭州產(chǎn)獨(dú)活中的異歐前胡素含量相差更為懸殊，接近9倍.說(shuō)明不同地域的氣候、土壤等條件，可能極大的影響?yīng)毣钪懈鞣N化學(xué)成分的含量.

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R927.2

A

1673-260X（2010）02-0063-03