• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    生物反硝化脫氮碳源上微生物的多樣性

    2010-10-13 02:22:40王小嬌席亞萍
    關(guān)鍵詞:玉米芯離心管電泳

    王小嬌 席亞萍 張 明

    華東師范大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 (上海 200062)

    生物反硝化脫氮碳源上微生物的多樣性

    王小嬌 席亞萍 張 明

    華東師范大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 (上海 200062)

    為了研究廢棄農(nóng)作物作為反硝化脫氮處理的新型碳源和生物膜載體中微生物的多樣性及微生物的群落結(jié)構(gòu),將玉米芯作為反硝化碳源和生物膜的載體布置在河道中,采集同步脫氮過程中的玉米芯樣品并提取微生物總DNA,使用細(xì)菌通用引物對(duì)(GC341F和518R)從總DNA中成功擴(kuò)增出目標(biāo)16SrDNA片段,然后對(duì)擴(kuò)增的16SrDNA進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)測(cè)定,對(duì)凝膠染色并進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)分析和切膠測(cè)序。結(jié)果表明以玉米芯為載體的生物膜優(yōu)勢(shì)菌變化規(guī)律與生存環(huán)境的變化存在較好的相關(guān)性,當(dāng)水體中溶解氧提高后,生物膜上的優(yōu)勢(shì)種群以好氧/兼氧的異養(yǎng)桿狀細(xì)菌Bacillus為主。

    16SrDNA PCR DGGE

    0 引言

    由于城市化進(jìn)程的加快和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展,氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素通過多種途徑匯入河流等水體,造成水體污染和富營(yíng)養(yǎng)化問題日益突出。我國(guó)南方河流普遍存在低碳高氮現(xiàn)象,水體磷氮比過低使河流自凈過程中反硝化所需的碳源不足,導(dǎo)致硝態(tài)氮難以有效去除。

    本測(cè)試基于生物硝化-反硝化原理,研究了在模擬河道中提高水體中的碳濃度,營(yíng)造反硝化環(huán)境,這種好氧、兼氧的生物膜環(huán)境為脫氮提供了良好的環(huán)境。盡管很多研究者對(duì)脫氮的工藝條件進(jìn)行了大量研究,但是對(duì)其脫氮的微生物機(jī)理尚不清楚,現(xiàn)代分子生物學(xué)為深入研究環(huán)境中微生物提供了先進(jìn)的技術(shù)手段。

    通過從模擬河道裝置中提取總DNA,并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和變性梯度凝膠(DGGE)和DNA測(cè)序等新的分子生物學(xué)技術(shù),對(duì)生物膜中細(xì)菌多樣性和微生物群落進(jìn)行了研究,以獲得生物膜中細(xì)菌組成和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

    1 材料和方法

    1.1 樣品的采集

    待模擬河道裝置開始運(yùn)行后,分別選取不同的時(shí)間點(diǎn),采集載體玉米芯上的生物膜,具體采樣時(shí)間及裝置的運(yùn)行狀態(tài)見表1。

    表1 采樣點(diǎn)時(shí)間及運(yùn)行狀態(tài)表

    1.2 總DNA的提取

    將從反應(yīng)器中采集的玉米芯樣品切割成2 cm大小,放入經(jīng)滅菌處理的含100 mL磷酸鹽緩沖溶液和玻璃珠(直徑3~4 mm)的三角燒瓶中,漩渦振蕩60 min,將玉米芯表面生物膜充分剝離,取含生物膜的液體部分10 000 r/min離心8 min,棄去上清液,沉淀部分即為含玉米芯表面生物膜的樣品。

    離心沉淀的生物膜樣品采用進(jìn)口的FastDNA SPIN Kit for Soi(lQ-biogene,CA,USA)試劑盒進(jìn)行總DNA的抽提和純化。過程如下:取300 μL生物膜樣品加入122 μL的MT緩沖液,用珠磨器(Mini Beadbeater,USA)震蕩破碎樣品40 s;將離心管中的樣品在12 000 r/min下離心30 s;將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中,加入250 μL PPS溶液,用手震蕩混勻10次;在12 000 r/min下將離心管中混勻的樣品離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移到15 mL的干凈離心管中;在15 mL離心管中加入1 mL吸附懸浮液;顛倒混勻離心管2 min,靜置沉淀3 min;沉淀后移除500 μL上清液,將離心管中樣品重新混勻,吸出600 μL混和液到試劑盒提供的Spin濾管中,在12 000 r/min下離心1 min;將剩余的混和液加入Spin濾管中離心;在Spin濾管中加入500 μL SEWS-M溶液,在12 000 r/min下離心1 min;棄去離心液,繼續(xù)在12 000 r/min下離心2 min,以干燥剩余的SEWS-M溶液;將SpinTM濾管放入另一個(gè)干凈的離心管中,在室溫下放置干燥5 min;在SpinTM濾管中加入60 μL超純水,手指輕彈管壁,在12 000 r/min下離心1 min,離心液即為提取的DNA樣品。

    采用紫外分光光度法對(duì)提取的總DNA進(jìn)行定量測(cè)定。目前認(rèn)為,在波長(zhǎng)260 nm紫外線下,1OD(光密度數(shù))的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50 μg/mL。采用微量石英比色皿中將提取的DNA樣品稀釋后測(cè)定A260的數(shù)值,則DNA濃度C(ng/μL)=A260×稀釋倍數(shù)/0.02。

    1.3 PCR擴(kuò)增

    1.3.1 引物

    根據(jù)文獻(xiàn),選用真細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)通用擴(kuò)增引物GC341F(5'CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGC GGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAG CAG 3')和518R(5'CGTATTACCGCGGCTGCTGG 3'),引物由上海生工公司合成。

    1.3.2 擴(kuò)增體系

    PCR擴(kuò)增體系為:Taq DNA聚合酶0.15 μL(5 U/μL),10倍反應(yīng)緩沖液為3 μL,其中Mg2+為1.8 μL(25 mmol),dNTP(10 mmol)為3 μL,引物為0.5 μL(10 μmol PL),最后加滅菌的ddH2O至體積為30 μL。PCR試劑購(gòu)自上海生工公司。

    1.3.3 擴(kuò)增程序

    PCR反應(yīng)在PCR儀(PTC-0200G、ALS-1244G、Bio-Rad,USA)上進(jìn)行,反應(yīng)過程為94℃變性5 min,然后94℃變性50 s,54℃退火50 s,72℃延伸2.5 min,循環(huán)29次,然后在72℃保持10 min。

    1.3.4 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

    用1%瓊脂糖凝膠電泳,核酸染料染色并拍照(Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng),BIO-RAD,USA)。電泳檢測(cè)時(shí)采用Marker DL2000(2 000、1 000、750、500、250、100 bp)作為分子量大小的標(biāo)記。

    1.3.5 DGGE分析

    采用Dcode Universal Mutation System DGGE電泳系統(tǒng)(Bio-rad,USA)進(jìn)行DGGE分析,10%聚丙烯酰胺凝膠,變性梯度35%~55%(100%變性劑含7 mol·L-1尿素和40%去離子甲酰胺),上樣量為25 μL PCR產(chǎn)物,60℃、85 V恒定電壓下電泳8 h。電泳結(jié)束后,凝膠用SYBR Green核酸染液染色30 min,于GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad,USA)上成像檢測(cè)并拍照。

    1.3.6 測(cè)序

    對(duì)聚丙烯酰胺凝膠上的目的條帶在Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)上(BIO-RAD,USA)進(jìn)行切膠,回收的凝膠條帶搗碎于30 μL無菌ddH2O中,放置過夜,讓凝膠上的DNA溶解,而后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用由上海生工合成的細(xì)菌16SrDNA通用引341F(5'CCTACGGGAGGCAGCAG 3')和518R(5'CGTATTACCGCGGCTGCTGG 3)'進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用于后續(xù)的DGGE.PCR擴(kuò)增體系為:Taq DNA聚合酶0.15 μL(5 U/μL),10倍反應(yīng)緩沖液為3 μL,其中Mg2+為1.8 μL(25 mmol),dNTP(10 mmol)為3 μL,引物為0.5 μL(10 μmol PL),最后加滅菌的ddH2O至體積為30 μL。PCR反應(yīng)的程序同1.3.3。PCR產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序。

    2 結(jié)果和分析

    2.1 生物膜總DNA的提取

    玉米芯生物膜樣品總DNA的提取是采用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行分析的前提和關(guān)鍵步驟。DNA提取純度影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增和多態(tài)性分析,提取的不完整性則會(huì)造成微生物種群多樣性的流失。從7個(gè)玉米芯生物膜樣品中提取的DNA通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)(見圖1)。

    圖1 玉米芯生物膜總DNA的提取

    電泳結(jié)果顯示,本研究采用的提取方法可以順利提取出樣品中的總DNA。

    2.2 PCR產(chǎn)物

    電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2。

    圖2 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖

    由圖2可知,用引物GC341F/518R對(duì)玉米芯生物膜總DNA樣品擴(kuò)增后的DNA片段大小約為220 bp,與相應(yīng)16SrDNA上目的片斷長(zhǎng)度177 bp和GC夾(40 bp)長(zhǎng)度之和相當(dāng),因此認(rèn)為用引物341FGC/518R對(duì)玉米芯生物膜DNA的PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠,可用于下一步DGGE分析。

    2.3 PCR-DGGE-切膠測(cè)序

    玉米芯生物膜總DNA的16SrDNA V3區(qū)片段DGGE指紋圖譜見圖3。

    圖3 玉米芯生物膜擴(kuò)增的16SrDNA進(jìn)行DGGE圖譜

    將玉米芯生物膜總DNA的16SrDNA V3區(qū)片段DGGE圖譜中的主要優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行DGGE切膠回收,采用PCR-DGGE凝膠電泳多次純化后切膠,PCR擴(kuò)增后送上海生工公司測(cè)序。

    2.4 優(yōu)勢(shì)菌群16SrDNA片段測(cè)序(比對(duì)結(jié)果見表2)

    表2 部分優(yōu)勢(shì)菌16SrDNA DGGE片斷測(cè)序分析結(jié)果

    表2 (續(xù))

    從表2可知,優(yōu)勢(shì)菌群主要包括Bacillus為好氧/兼氧的異養(yǎng)細(xì)菌,Clostridiaceae等均為兼氧/厭氧的異養(yǎng)細(xì)菌,體內(nèi)均含有硝酸還原酶。這與這些玉米芯所處的生境均相吻合。

    硝酸還原酶(nitrate reductase)可分為參與硝酸鹽同化的同化型還原酶和催化以硝酸鹽為活體氧化的最終電子受休的硝酸鹽呼吸異化型(呼吸型)還原酶。同化型存在于高等植物、藻類、菌類及細(xì)菌,是由含Mo、黃素和正鐵血紅素的亞單位所成的酶,即分子內(nèi)具有小的電子遞體。菠菜、小球藻的酶其分子量約20萬,作為電子供體,藍(lán)藻為鐵氧還蛋白,菌類主要為NADPH,而綠色植物主要為NADH,可由硝酸鹽誘導(dǎo),可被氨和有機(jī)氮的抑制。異化型酶存在于許多兼性好氧性細(xì)菌中,多為與膜結(jié)構(gòu)結(jié)合的不溶性的,一般含鐵及鉬分子量數(shù)十萬,似以細(xì)胞色素為電子供體,而專性嫌氣性細(xì)菌產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的酶是可溶性的,以鐵氧還蛋白為電子供體。

    3 結(jié)論

    本測(cè)試所用的方法能成功地提取玉米芯載體上微生物DNA。以玉米芯為載體和碳源的生物膜上優(yōu)勢(shì)種的變化規(guī)律與裝置的運(yùn)行狀況呈現(xiàn)較好的相關(guān)性:即當(dāng)水體溶解氧水平較低時(shí),生物膜上的優(yōu)勢(shì)種以兼氧/厭氧的Clostridium等反硝化異養(yǎng)菌為主,當(dāng)水體中溶解氧水平提高后,生物膜上的優(yōu)勢(shì)種以好氧/兼氧的Bacillus等異養(yǎng)桿狀細(xì)菌為主。好氧/兼氧的異養(yǎng)反硝化細(xì)菌的出現(xiàn)更好地為高溶解氧水平下模擬河道裝置的反硝化脫氮提供了理論支持。

    (略)

    Q935

    王小嬌 女 1982年生 華東師范大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院環(huán)境科學(xué)系在讀碩士 研究方向:環(huán)境微生物

    2010年3月

    猜你喜歡
    玉米芯離心管電泳
    魔方型離心管架的設(shè)計(jì)及研發(fā)
    科技視界(2020年26期)2020-09-24 03:25:06
    離心管架研究現(xiàn)狀及魔尺型離心管架的設(shè)計(jì)
    科技視界(2020年17期)2020-07-30 14:03:27
    輔助陽極在輕微型廂式車身電泳涂裝中的應(yīng)用
    白銀地區(qū)玉米芯金針菇高產(chǎn)栽培技術(shù)
    燃燒條件演示實(shí)驗(yàn)的新設(shè)計(jì)
    PPG第四屆電泳涂料研討會(huì)在長(zhǎng)沙成功舉辦
    上海建材(2017年4期)2017-04-06 07:32:03
    農(nóng)科問答
    改良的Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)胸腺肽分子量
    得閑愛搓玉米芯
    慢性心力衰竭患者血清蛋白電泳的特點(diǎn)及其與預(yù)后的相關(guān)性分析
    插逼视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 两个人的视频大全免费| 在线播放无遮挡| 伊人久久国产一区二区| 国产人妻一区二区三区在| 免费大片18禁| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 特级一级黄色大片| 老女人水多毛片| 五月天丁香电影| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国内精品美女久久久久久| 久久久久久九九精品二区国产| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲性久久影院| 晚上一个人看的免费电影| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲av成人精品一二三区| 成年版毛片免费区| 国产精品伦人一区二区| 嫩草影院新地址| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说 | 一级爰片在线观看| 老司机影院成人| 听说在线观看完整版免费高清| 日本午夜av视频| 国产又色又爽无遮挡免| 黄色配什么色好看| 久久精品国产亚洲网站| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲av国产av综合av卡| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 免费av不卡在线播放| 黄色配什么色好看| 国产精品一区二区性色av| 国产熟女欧美一区二区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日本熟妇午夜| 人妻一区二区av| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产探花在线观看一区二区| 国产 一区 欧美 日韩| 别揉我奶头 嗯啊视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 免费看av在线观看网站| 日韩一区二区三区影片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲四区av| 毛片女人毛片| 亚洲综合精品二区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 毛片一级片免费看久久久久| 一区二区三区四区激情视频| 视频中文字幕在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 我要看日韩黄色一级片| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 91久久精品国产一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 精品一区在线观看国产| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 一级毛片久久久久久久久女| 91久久精品国产一区二区成人| 69av精品久久久久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 99热全是精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| av黄色大香蕉| 一级爰片在线观看| 另类亚洲欧美激情| 精品酒店卫生间| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品久久久久久电影网| 国产综合精华液| 免费观看无遮挡的男女| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲欧洲日产国产| 大片电影免费在线观看免费| 97超视频在线观看视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久国产乱子免费精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产爱豆传媒在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 国产一区二区三区综合在线观看 | 欧美国产精品一级二级三级 | 久久精品国产a三级三级三级| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久99热6这里只有精品| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 老司机影院成人| 国产淫片久久久久久久久| 毛片女人毛片| 99久国产av精品国产电影| 国产精品久久久久久精品古装| 晚上一个人看的免费电影| 国产在视频线精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 青青草视频在线视频观看| 激情 狠狠 欧美| 国产视频首页在线观看| 欧美国产精品一级二级三级 | 日本一本二区三区精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲国产成人一精品久久久| 晚上一个人看的免费电影| 如何舔出高潮| 嘟嘟电影网在线观看| 香蕉精品网在线| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 欧美激情国产日韩精品一区| 午夜福利视频精品| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 91久久精品国产一区二区成人| 免费观看无遮挡的男女| 国产成人a∨麻豆精品| 美女内射精品一级片tv| 成人亚洲精品一区在线观看 | 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品午夜福利在线看| 九色成人免费人妻av| 久久久精品94久久精品| 天美传媒精品一区二区| 精品久久久久久久末码| 亚洲最大成人手机在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品一二三区在线看| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲久久久久久中文字幕| 极品少妇高潮喷水抽搐| 可以在线观看毛片的网站| 久久久欧美国产精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲最大成人中文| 岛国毛片在线播放| 色网站视频免费| 精品熟女少妇av免费看| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲av中文av极速乱| 免费看a级黄色片| 街头女战士在线观看网站| 美女主播在线视频| 亚洲国产av新网站| 精品午夜福利在线看| 亚洲国产欧美人成| 色吧在线观看| 精品一区二区免费观看| 亚洲国产av新网站| 国内揄拍国产精品人妻在线| 婷婷色综合大香蕉| 2022亚洲国产成人精品| 国产午夜福利久久久久久| 人妻一区二区av| 亚洲图色成人| 男插女下体视频免费在线播放| 综合色丁香网| 国产精品精品国产色婷婷| av一本久久久久| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人福利小说| 色哟哟·www| 国产亚洲91精品色在线| 99热网站在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日本色播在线视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 中文欧美无线码| 深夜a级毛片| 欧美日韩视频精品一区| 婷婷色综合大香蕉| 国产一区二区在线观看日韩| 少妇人妻 视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 日韩一区二区三区影片| 久久久色成人| 国产老妇伦熟女老妇高清| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久女婷五月综合色啪小说 | 欧美成人精品欧美一级黄| 天堂网av新在线| 99久久九九国产精品国产免费| 国产爱豆传媒在线观看| 大片免费播放器 马上看| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲人成网站在线播| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 在线看a的网站| 草草在线视频免费看| 嫩草影院精品99| 老司机影院成人| 亚洲图色成人| av在线亚洲专区| 在线看a的网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 男女国产视频网站| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产综合懂色| 日本熟妇午夜| 久久热精品热| 精品一区二区免费观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产片特级美女逼逼视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 一个人看视频在线观看www免费| 久久99蜜桃精品久久| 色视频在线一区二区三区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 亚洲国产欧美人成| av女优亚洲男人天堂| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 女人久久www免费人成看片| 2022亚洲国产成人精品| www.色视频.com| 我要看日韩黄色一级片| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 91精品国产九色| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲成人一二三区av| 国产色婷婷99| 欧美黄色片欧美黄色片| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 街头女战士在线观看网站| xxx大片免费视频| 中文字幕av电影在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 午夜福利,免费看| 国产成人精品久久二区二区91 | 制服人妻中文乱码| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲欧美一区二区三区国产| 99久久人妻综合| 亚洲,欧美精品.| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品国产乱码久久久久久小说| e午夜精品久久久久久久| 十分钟在线观看高清视频www| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品久久久久成人av| 久久久久久人人人人人| 赤兔流量卡办理| 久久人妻熟女aⅴ| 国产 一区精品| 黑人猛操日本美女一级片| 美国免费a级毛片| 老汉色∧v一级毛片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产av码专区亚洲av| 少妇被粗大猛烈的视频| 中文字幕最新亚洲高清| www日本在线高清视频| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲男人天堂网一区| 男女下面插进去视频免费观看| 日本wwww免费看| 午夜免费鲁丝| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产精品一区二区在线观看99| 街头女战士在线观看网站| 午夜久久久在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 午夜影院在线不卡| 电影成人av| 欧美久久黑人一区二区| 热99国产精品久久久久久7| 国产深夜福利视频在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 精品福利永久在线观看| e午夜精品久久久久久久| 国产成人免费无遮挡视频| 婷婷色av中文字幕| 久热这里只有精品99| 亚洲七黄色美女视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 青青草视频在线视频观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产av码专区亚洲av| 国产国语露脸激情在线看| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产乱来视频区| 两个人免费观看高清视频| 51午夜福利影视在线观看| 99热网站在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲成人国产一区在线观看 | 亚洲av中文av极速乱| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 各种免费的搞黄视频| 人人澡人人妻人| 亚洲国产精品成人久久小说| 男人舔女人的私密视频| 热99久久久久精品小说推荐| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一区在线观看完整版| www.精华液| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产精品一二三区在线看| 午夜影院在线不卡| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品自拍成人| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 在线观看三级黄色| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产日韩欧美视频二区| 国产日韩欧美在线精品| 精品酒店卫生间| 十八禁人妻一区二区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲熟女毛片儿| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 黑丝袜美女国产一区| 国产男人的电影天堂91| 国产乱来视频区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲伊人久久精品综合| av女优亚洲男人天堂| kizo精华| 少妇被粗大猛烈的视频| 丝袜美足系列| 久久久国产欧美日韩av| 美女大奶头黄色视频| 久久久久久久久免费视频了| 久久久久久久国产电影| 成人亚洲欧美一区二区av| 成年女人毛片免费观看观看9 | 精品一区二区三卡| 中文天堂在线官网| 亚洲国产精品一区三区| 免费黄网站久久成人精品| 在线天堂最新版资源| 成人三级做爰电影| 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品国产av在线观看| 中文欧美无线码| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 成年人免费黄色播放视频| 视频区图区小说| 午夜福利影视在线免费观看| 美女午夜性视频免费| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品一区二区在线不卡| 老汉色∧v一级毛片| 久久久国产精品麻豆| 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品熟女久久久久浪| 少妇被粗大的猛进出69影院| 只有这里有精品99| 高清不卡的av网站| 十八禁高潮呻吟视频| 在线看a的网站| 国产精品三级大全| 性色av一级| 国产毛片在线视频| av福利片在线| 高清欧美精品videossex| 午夜福利,免费看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲精品在线美女| 国产成人精品久久二区二区91 | 在线免费观看不下载黄p国产| 90打野战视频偷拍视频| 男女边吃奶边做爰视频| 秋霞在线观看毛片| 大陆偷拍与自拍| 精品第一国产精品| 老熟女久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 国产国语露脸激情在线看| 日韩免费高清中文字幕av| avwww免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美另类一区| 悠悠久久av| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲熟女毛片儿| 成人免费观看视频高清| 成年女人毛片免费观看观看9 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 精品一区在线观看国产| 性色av一级| 波野结衣二区三区在线| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 九色亚洲精品在线播放| 久久av网站| 精品一区二区免费观看| 亚洲一区中文字幕在线| 天天影视国产精品| 十八禁人妻一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美97在线视频| 国产精品国产三级专区第一集| 91精品国产国语对白视频| 亚洲第一av免费看| 91国产中文字幕| 久久青草综合色| 少妇精品久久久久久久| 国产极品天堂在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲天堂av无毛| 亚洲欧美清纯卡通| 久久天堂一区二区三区四区| 又大又黄又爽视频免费| 美女国产高潮福利片在线看| 精品亚洲成国产av| 欧美精品一区二区大全| 久久99热这里只频精品6学生| 波多野结衣av一区二区av| 最新的欧美精品一区二区| 高清不卡的av网站| 国产高清不卡午夜福利| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 五月天丁香电影| 欧美黑人欧美精品刺激| 日日撸夜夜添| 麻豆乱淫一区二区| 人体艺术视频欧美日本| 搡老乐熟女国产| 伊人久久国产一区二区| 亚洲精品视频女| 9191精品国产免费久久| 国产成人免费观看mmmm| 午夜福利影视在线免费观看| 精品一区二区三卡| 街头女战士在线观看网站| 亚洲成人手机| 青春草视频在线免费观看| 伊人亚洲综合成人网| 色视频在线一区二区三区| 丝瓜视频免费看黄片| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产精品免费视频内射| 国产不卡av网站在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品久久久久成人av| 蜜桃在线观看..| 亚洲美女视频黄频| 午夜福利影视在线免费观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 丝袜人妻中文字幕| 丁香六月欧美| 国产精品久久久av美女十八| 欧美日韩成人在线一区二区| 色播在线永久视频| 亚洲国产看品久久| 91aial.com中文字幕在线观看| 美女福利国产在线| 宅男免费午夜| 精品国产一区二区久久| 九色亚洲精品在线播放| 大香蕉久久网| www.熟女人妻精品国产| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲成人av在线免费| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩一区二区视频免费看| 操美女的视频在线观看| 黄色 视频免费看| 又大又爽又粗| av女优亚洲男人天堂| 欧美日韩综合久久久久久| 国产99久久九九免费精品| a级片在线免费高清观看视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丝瓜视频免费看黄片| 一区在线观看完整版| 久久人人爽人人片av| 母亲3免费完整高清在线观看| 无限看片的www在线观看| 国产成人精品福利久久| 亚洲国产精品一区三区| 人妻 亚洲 视频| 亚洲综合色网址| 波多野结衣av一区二区av| bbb黄色大片| 婷婷色av中文字幕| 男女边摸边吃奶| 成年人午夜在线观看视频| 国产熟女欧美一区二区| 久久 成人 亚洲| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产男女内射视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 一区二区av电影网| 在线观看www视频免费| 久久免费观看电影| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日韩大片免费观看网站| 另类精品久久| 一区二区三区精品91| 亚洲五月色婷婷综合| 老鸭窝网址在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产有黄有色有爽视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲中文av在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜免费男女啪啪视频观看| www.精华液| 美女中出高潮动态图| 成人三级做爰电影| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 男人舔女人的私密视频| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 老司机影院成人| 久久久亚洲精品成人影院| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲国产欧美网| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 9色porny在线观看| 日韩一区二区视频免费看| av一本久久久久| 熟女av电影| 日本av手机在线免费观看| 国产欧美亚洲国产| 大片免费播放器 马上看| 黑丝袜美女国产一区| 无限看片的www在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 精品福利永久在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 热re99久久精品国产66热6| 中文字幕人妻熟女乱码| 老熟女久久久| 亚洲精品乱久久久久久| 男女无遮挡免费网站观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲美女黄色视频免费看| 国产精品蜜桃在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 色婷婷av一区二区三区视频| 搡老岳熟女国产| 欧美另类一区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久青草综合色| 天天添夜夜摸| 一本大道久久a久久精品| 亚洲av日韩在线播放| 久久久久国产精品人妻一区二区| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲精品国产区一区二| 国产精品一国产av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 少妇人妻精品综合一区二区| 一级片免费观看大全| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产黄色免费在线视频| 亚洲熟女毛片儿| 日本av免费视频播放| 飞空精品影院首页| 免费在线观看黄色视频的| 韩国精品一区二区三区| 少妇人妻久久综合中文| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲国产欧美在线一区| 在线观看免费视频网站a站| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲国产精品一区三区| 捣出白浆h1v1| 国产成人a∨麻豆精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 99久国产av精品国产电影| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 一区二区三区乱码不卡18|