過氧化氫對嗎啡依賴的SH－SY5Y細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

張玉柯，王振華，張娟，李惠，鄭秋生

（石河子大學(xué)藥學(xué)院／新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002）

過氧化氫對嗎啡依賴的SH－SY5Y細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

張玉柯，王振華，張娟，李惠，鄭秋生

（石河子大學(xué)藥學(xué)院／新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002）

為探討H2O2對嗎啡依賴的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH－SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，應(yīng)用H2O2在嗎啡依賴的SH－SY5Y細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分別利用MTT法測定細(xì)胞存活率、Hoechst33258熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡和DCFH－DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果表明：100－400μmol／L H2O2處理長期嗎啡作用的SH－SY5Y細(xì)胞，使細(xì)胞的存活率明顯降低、凋亡率顯著增加，嗎啡時間依賴性的誘導(dǎo)SH－SY5Y細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，H2O2處理嗎啡長期作用的SH－SY5Y細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)一步升高；NAC預(yù)處理長期嗎啡作用的SHSY5Y細(xì)胞可阻斷嗎啡引起SH－SY5Y細(xì)胞存活率的降低、細(xì)胞凋亡率的增加及細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高，由此可知，NAC能明顯保護(hù)SH－SY5Y細(xì)胞對抗嗎啡引起的損傷，降低ROS的水平可能是NAC的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制之一。

嗎啡依賴；活性氧；N－乙酰－半胱氨酸

阿片類藥物廣泛用于鎮(zhèn)痛，而長時間使用阿片類藥物，可導(dǎo)致阿片耐受和依賴［1］，阿片類藥物濫用成癮己成為嚴(yán)重的社會問題。目前對阿片依賴的機(jī)制尚未明確。

嗎啡依賴的形成與活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基關(guān)系密切，氧化應(yīng)激是嗎啡依賴產(chǎn)生和發(fā)展的一個重要機(jī)制［2］。有研究報道［3］，嗎啡可誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞產(chǎn)生ROS，納洛酮預(yù)處理嗎啡長期作用的HUVECs細(xì)胞，可以逆轉(zhuǎn)嗎啡引起的HUVECs細(xì)胞活力的下降、ROS的產(chǎn)生、線粒體膜電位（MMPs）下降等。阿片類藥物的代謝產(chǎn)物可直接參與腎小球膜細(xì)胞中過氧化物的產(chǎn)生［4］?？寡?化 劑 N－乙 酰－半 胱 氨 酸 （N－acetyl cysteine，NAC）能抑制嗎啡誘導(dǎo)的肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［5］。種種跡象都表明，在阿片耐受和依賴的形成過程中，伴隨著ROS的產(chǎn)生，ROS能通過氧化作用攻擊細(xì)胞的生物大分子，從而可能降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶、非酶抗氧化劑等的活性，使機(jī)體清除ROS的能力降低。ROS與嗎啡依賴和戒斷密切相關(guān)。氧化損傷可能是產(chǎn)生嗎啡成癮的重要原因。

本研究采用H2O2作用于長期嗎啡作用的SHSY5Y細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，觀察其對長期嗎啡作用的SH－SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，以及NAC預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。初步探討抗氧化劑在緩解藥物成癮行為中可能存在的作用與意義。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

SH－SY5Y 細(xì) 胞 株；DMEM 培 養(yǎng) 基，Hoechst33258染 液，全 反 式 維 甲 酸 （all－trans－retinoic acid，RA）、NAC、［3－4，5－dimethylthiazol－2－yl］－2，5－diphenyl tetrazolium bromide（MTT），還原型二氯熒光素－二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH－DA）均購自Sigma公司；特級胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司；鹽酸嗎啡注射液（批號TD2006－0119）購自青海制藥廠有限公司；鹽酸納洛酮注射液（批號20023762）購自北京華素制藥股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)和RA誘導(dǎo)細(xì)胞分化

SH－SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清、100U／mL青霉素、100mg／mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。10μmol／L RA誘導(dǎo)SH－SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元型分化，增加細(xì)胞表面μ－阿片受體的表達(dá)，RA 作用6d，隔天換1次液［6－7］，于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1．3 嗎啡依賴模型的建立及細(xì)胞分組處理

10μmol／L嗎啡作用于經(jīng)RA分化培養(yǎng)的SHSY5Y細(xì)胞24h后，PBS潤洗細(xì)胞，進(jìn)行納洛酮（濃度為10μmol／L）急性阻斷［8］；嗎啡與納洛酮（濃度均為10μmol／L）共孵育細(xì)胞24h，進(jìn)行納洛酮慢性阻斷。

H2O2誘導(dǎo)長期嗎啡作用的SH－SY5Y細(xì)胞損傷模型的制備參照文獻(xiàn)［9－10］。細(xì)胞分組：將長期嗎啡作用的SH－SY5Y細(xì)胞分為對照組、H2O2組、NAC組及空白對照組。1）對照組：嗎啡作用SHSY5Y細(xì)胞24h后，進(jìn)行納洛酮急（慢）性阻斷；2）H2O2組：不同濃度的 H2O2（50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L、300μmol／L）作用于經(jīng)納洛酮急（慢）性阻斷的SH－SY5Y 細(xì)胞4h；3）NAC組：100 μmol／LNAC預(yù)處理細(xì)胞1h，進(jìn)行納洛酮急（慢）性阻斷；4）空白對照組：不加任何處理。以上各組最后均置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1．4 MTT法檢測細(xì)胞活力

采用MTT法測定細(xì)胞的生長活力［11］。經(jīng)RA分化的SH－SY5Y細(xì)胞接種24h后，不同濃度的H2O2（50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L、300 μmol／L、400μmol／L）或者 NAC（100μmol／L、200 μmol／L、300μmol／L、400μmol／L）分別作用 SHSY5Y細(xì)胞24h，并置于5%、37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。最后每孔加入 MTT溶液10μL（5μg／mL）繼續(xù)培養(yǎng)4h，經(jīng)處理后于多功能酶標(biāo)儀于570 nm（630nm校準(zhǔn)）波長下測定各孔吸光度。

存活率＝（OD試驗(yàn)組／OD對照組）×100%。

1．5 細(xì)胞凋亡的熒光染色檢測

收集經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞，離心棄上清，加入終濃度為104μg／L的Hoechst33258熒光染液，混勻，37℃孵育10min［12］。最后于熒光顯微鏡下觀察、拍片。

1．6 細(xì)胞內(nèi)的ROS水平測定

10μmol／L嗎啡分別作用經(jīng)RA分化的SHSY5Y細(xì)胞10min、2h、4h、12h和24h后，進(jìn)行納洛酮急性阻斷；不同濃度的 H2O2（50μmol／L、100 μmol／L、200μmol／L、300μmol／L）作用于嗎啡長期處理的SH－SY5Y細(xì)胞4h；或100μmol／L NAC預(yù)處理嗎啡急性作用、納洛酮急／慢性阻斷的SHSY5Y細(xì)胞1h。收集經(jīng)上述處理的細(xì)胞，加入10 mol／LDCFH－DA，37℃孵育30min，最后測定其熒光強(qiáng)度，激發(fā)光為485nm，發(fā)射光為525nm［13］。結(jié)果以1×105細(xì)胞的熒光強(qiáng)度表示。

1．7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用表示，采用SPSS10．0軟件包，進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 RA誘導(dǎo)SH－SY5Y細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察，正常SH－SY5Y細(xì)胞胞體大小不均，胞核大，核仁多而明顯。經(jīng)RA誘導(dǎo)分化后，可見細(xì)胞核變小且較規(guī)則一致，胞體呈圓形或多角形，出現(xiàn)樹突狀突起，分布成網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞分化特征明顯。

2．2 MTT檢測細(xì)胞活力

如圖1所示，H2O2和NAC對細(xì)胞活力的影響在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系。300μmol／L H2O2可以使細(xì)胞存活率降低至52．1%±1．2%（圖1a）；100μmol／L NAC有較強(qiáng)的自由基清除能力，能顯著提高細(xì)胞的活力，從而拮抗嗎啡誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)（圖1b）。

圖1 H2O2／NAC對SH－SY5Y細(xì)胞活力的影響Fig．1Effects of H2O2／NAC on SH－SY5Ycells survival

2．3 細(xì)胞凋亡的熒光染色檢測

圖2 細(xì)胞凋亡的熒光觀察Fig．2The determination of morphological apoptosis

如圖2所示，正常細(xì)胞核的Hoechst著色形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒（圖2a）；10μmol／L嗎啡作用SH－SY5Y細(xì)胞24h后，其核由于濃集而呈亮蘭色，出現(xiàn)部分凋亡形態(tài)（圖2b）；300μmol／L H2O2處理嗎啡長期作用的SH－SY5Y細(xì)胞4h后，其核呈分葉，碎片狀，邊集，H2O2進(jìn)一步誘導(dǎo)了SH－SY5Y細(xì)胞的凋亡（圖2c）；100μmol／L抗氧化劑NAC預(yù)處理嗎啡長期作用的SHSY5Y細(xì)胞1h后，細(xì)胞凋亡形態(tài)少見（圖2d）。

2．4 細(xì)胞內(nèi)的ROS水平檢測

10μmol／L嗎啡分別作用于經(jīng)RA分化的SHSY5Y細(xì)胞10min、2h、4h、12h和24h并進(jìn)行納洛酮急性阻斷，結(jié)果見圖3。圖3顯示，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平隨著嗎啡處理時間的延長而升高。在12h時，即可達(dá)到一個較高水平，為（0．453±0．013）／105個細(xì)胞（圖3a）。不同濃度H2O2作用于納洛酮急／慢性阻斷的SH－SY5Y細(xì)胞4h后；與未經(jīng)H2O2處理組比較，ROS的水平隨著H2O2處理濃度的升高而升高，150μmol／L H2O2即可產(chǎn)生較高的熒光強(qiáng)度，分別為（0．532±0．015）／105個細(xì)胞、（0．343±0．013）／105個細(xì)胞（圖3b）。NAC（100μmol／L）預(yù)處理嗎啡急性作用、納洛酮急／慢性阻斷的SHSY5Y細(xì)胞1h后，NAC通過清除自由基，使細(xì)胞內(nèi)ROS的含量有所下降（圖3c）。與未經(jīng)嗎啡處理組比較，納洛酮急性阻斷組和納洛酮慢性阻斷組：P＜0．01（差異均有統(tǒng)計學(xué)意義）；但嗎啡急性作用組與對照組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 SH－SY5Y細(xì)胞內(nèi)的ROS水平Fig．3The accumulation of ROS in SH－SY5Ycells

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先從形態(tài)學(xué)上觀察到，嗎啡長期作用誘導(dǎo)了SH－SY5Y細(xì)胞凋亡。H2O2可進(jìn)一步誘導(dǎo)嗎啡依賴的SH－SY5Y細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞內(nèi)ROS的水平顯著升高；NAC作用于長期嗎啡的SH－SY5Y細(xì)胞，顯著提高了細(xì)胞的活力、降低了細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，抗氧化劑對長期嗎啡的SH－SY5Y細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。

μ－阿片受體在細(xì)胞介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、ROS產(chǎn)生、Caspase級聯(lián)反應(yīng)中起重要作用。嗎啡長期處理SH－SY5Y細(xì)胞，其通過作用于細(xì)胞表面的μ－阿片受體誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。而ROS作為一種細(xì)胞內(nèi)特殊的信號分子，具有高度的化學(xué)活性［14］，通過氧化還原修飾影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。ROS造成的損傷和凋亡是許多疾病發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，特別是在阿片耐受、依賴的調(diào)控中起重要作用［2－15］。其參與阿片耐受、依賴的可能機(jī)制是：ROS作為配體通過激活細(xì)胞表面的阿片受體，并與之結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器活性的變化，使得ROS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與嗎啡依賴和戒斷的受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行信號交流和整合，從而參與到嗎啡依賴的機(jī)制中，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，嚴(yán)重影響了正常的生理功能?？寡趸瘎㎞AC可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)而參與自由基清除活動［16］，從而阻斷上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

目前對于阿片信號與ROS的聯(lián)系知之甚少。進(jìn)一步深入研究ROS對阿片耐受和依賴的調(diào)節(jié)作用，可以為最終闡明阿片耐受和依賴的分子機(jī)制提供有力的證據(jù)，本實(shí)驗(yàn)對二者之間的聯(lián)系進(jìn)行了初步探討，從自由基的角度給治療阿片依賴和預(yù)防復(fù)吸提供了新的治療方案。為抗氧化劑在改善和緩解嗎啡戒毒反應(yīng)、研制鎮(zhèn)痛復(fù)方等方面的臨床應(yīng)用提供了新思路。

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Effect of H2O2on ROS Production in Morphine－Dependent Human Neuroblastoma SH－SY5YCells

ZHANG Yuke，WANG Zhenhua，ZHANG Juan，LI Hui，ZHENG Qiusheng
（School of Pharmacy，Shihezi University／Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources，Ministry of Education，Shihezi 832002，China）

To explore the effect of hydrogenperoxide（H2O2）on ROS production in morphine－dependent human neuroblastoma SH－SY5Ycells．Morphine－dependent human neuroblastoma SH－SY5Ycells were used to set up the oxidative stress injury experiment model by using H2O2．Viability of cells were measured by MTT assay．The apoptotic cells were assessed by Hoechst 33258stain．Levels of ROS in SH－SY5Ycells were assessed by 2’7’－dichlorodihydrofluorescin fluorescence．Results showed that H2O2at 100μmol／L to 400μmol／L reduced the cell viability and increased the apoptotic percentage．Morphine time－dependently resulted in the increase of ROS．H2O2markedly induced the overproduction of ROS in morphine－dependent human neuroblastoma SH－SY5Ycells．However，pretreatment with N－acetyl－cysteine（NAC）markedly attenuated cell viability loss，cells apoptosis and the increase in ROS levels in morphine－dependent human neuroblastoma SH－SY5Ycells．These datas showed that NAC could protect human neuroblastoma SHSY5Ycells against morphine－induced damage，which was associated with the inhibition of the production of ROS induced by morphine．

morphine dependence；reactive oxygen species；N－acetyl－cysteine

R285．5

A

2010－02－26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（3086154）

張玉柯（1984－）女，碩士生，專業(yè)方向?yàn)樗幬镏苿?/p>

鄭秋生（1963－），男，教授，從事藥物制劑的研究；e－mail：kz－shz＠163．com。