綿羊MHC區(qū)段BAC克隆探針的制備

鄒毅輝，李鑫，李峰，薛峰，陳芳，高劍峰

（石河子大學生命科學學院，石河子832003）

綿羊MHC區(qū)段BAC克隆探針的制備

鄒毅輝，李鑫，李峰，薛峰，陳芳，高劍峰

（石河子大學生命科學學院，石河子832003）

為了摸索適用于高通量核酸雜交篩選的探針的制備方法，采用GeneQuest軟件分析并選取限制性內(nèi)切酶BseDⅠ酶切 MHC區(qū)段BAC克隆374N21，對酶切產(chǎn)物32P末端標記，并采用 Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit純化后放射自顯影檢測的方法。結(jié)果顯示：酶切結(jié)果與軟件分析一致，純化后探針分布為0．5～2．0kb，純化回收效率為60%。探針的分布合理，質(zhì)量較高，可滿足高通量雜交篩選的需要。

32P標記；綿羊；MHC；放射性自顯影；DNA探針

主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）是被廣泛研究的1個基因組區(qū)域。MHC的主要作用有：MHC以特殊的方式參與移植反應；MHC基因的產(chǎn)物廣泛參與所有哺乳動物的免疫反應的遺傳控制。目前國內(nèi)外關于MHC的遺傳組成，結(jié)構(gòu)與功能的研究已經(jīng)進行了大量的工作，并取得了很大的進展，但綿羊MHC基因的組成及功能研究報道較少。我國是綿羊資源品種豐富的國家，擁有很多特有的地方品種資源，因此開展我國綿羊的MHC研究，發(fā)現(xiàn)一些抗病基因，在我國的綿羊抗病育種等領域具有重要的作用。

詹勇華等［1］利用細菌人工染色體的載體pCC1BAC構(gòu)建了中國美利奴細毛羊的基因組BAC文庫，克隆總數(shù)約19萬個，非重組率為3．2%，平均插入片段大小約為133kb，約7．8倍基因組覆蓋率。并繪制出第一張最詳細的反芻動物MHC區(qū)域的物理圖譜。連續(xù)多次傳代培養(yǎng)文庫實驗證實文庫克隆的遺傳穩(wěn)定性好［1］，為研究和篩選綿羊 MHC區(qū)段基因提供了良好的平臺［2］。

噬菌體原位雜交的方法可以成功的從大片段基因組DNA中分離和鑒定出編碼序列，這種方法工作量大，但是較為簡便和實用，1次可對數(shù)百個kb基因組DNA區(qū)域內(nèi)的表達序列進行篩選［3］。高質(zhì)量的探針制備是雜交篩選成功的最重要的前提條件。本研究通過對32P標記綿羊MHC區(qū)段BAC克隆探針制備方法的研究，旨在為快速，準確篩選綿羊MHC區(qū)段基因奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

中國美利奴細毛羊BAC文庫MHC區(qū)段374N21（編號表示該克隆位于第374號文庫保存平板第N行第21列）BAC克隆。

BseD I限制性內(nèi)切酶訂購自Fermentas公司，Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit，10 μCi／μL32P訂購自北京福瑞公司。

1．2 方法

1．2．1 GeneQuest軟件分析374N21BAC克隆酶切位點

利用GeneQuest軟件分析374N21BAC克隆，選擇酶切后片段分布在2．5kb以下的限制性內(nèi)切酶BseDⅠ。

1．2．2 374N21BAC克隆質(zhì)粒的提取

從－80℃冰箱取出BAC文庫，在超凈工作臺中用接種環(huán)沾取374N21BAC克隆菌液，在平板上劃線。37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落到含12．5μg／mL氯霉素液體培養(yǎng)基，37 ℃，180r／min過夜培養(yǎng)8～12h，采用堿裂解法提取374N21 BAC克隆質(zhì)粒［4］。

1．2．3 綿羊 MHC class I區(qū)段374N21BAC克隆質(zhì)粒的酶切

在55℃反應條件下用BseDI酶切374N21 BAC克隆質(zhì)粒4h。取酶切產(chǎn)物10μL瓊脂糖電泳檢測。

1．2．432P末端標記法標記探針

取酶切產(chǎn)物4μL，加入10×Buffer 4．0μL，3×dNTPs（dATP，dGTP，dTTP 2mol／L each）5．0μL，Klenow Fragment（10U／μL）0．2μL，ddH2O 22．8 μL，［a－32P］－dCTP（10μCi／μL）4．0μL。30℃反應30 min。70℃加熱5min，終止反應，取10μL用1．5%瓊脂糖凝膠電泳。另取1．0μL進行盤分析定量。

1．2．5 探針純化及電泳放射性自顯影檢測

取20μL的探針反應體系，用 Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit純化，60μL ddH2O洗脫，取10μL，用1．0%瓊脂糖凝膠電泳后放射自顯影鑒定探針標記及洗脫情況。另取1．0μL進行盤分析定量。

2 結(jié)果與分析

2．1 374N21BAC克隆酶切結(jié)果

限制性內(nèi)切酶BseDⅠ酶切結(jié)果顯示與GeneQuest軟件分析結(jié)果一致（圖1、圖2）。酶切后的片段分布在2kbp以下。

圖1 374N21隆GeneQuest軟件酶切Fig．1Plasmid DNA digestion by GeneQuest software

圖2 374N21克隆BseDI酶切電泳Fig．2Plasmid DNA digestion by BseDI

2．2 探針純化結(jié)果

探針經(jīng)Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit純化后凝膠電泳和放射性自顯影結(jié)果（圖3）顯示探針分布在0．5～2．0kb。其純化效果明顯，有效的去除小片段核酸，且放射性強度能夠滿足雜交后進行自顯影以便對目的片段進行定位的要求。

2．3 探針的定量

洗脫前探針濃度為0．1μg／μL，20μL的體系總的探針含量為2．0μg，純化后探針濃度為0．02 μg／μL，純化后探針總量為1．2μg，回收效率為60%（圖4）。

圖3 探針純化結(jié)果Fig．3The probes of purification

圖4 探針盤分析定量Fig．4Quantitative probes by plate assay

3 討論

動物的MHC對了解動物發(fā)病、育種等方面具有很高的價值。對人［5］、老鼠［6］、雞［7］、牛［8］和羊［9］的研究表明了MHC與疾病的抗性、易感性和發(fā)病過程是相聯(lián)系的。目前，國內(nèi)外關于MHC的遺傳組成，結(jié)構(gòu)與功能的研究已經(jīng)進行了大量的工作，并取得了很大的進展，但綿羊MHC研究較少，且多數(shù)集中在基因多態(tài)性的研究［10］。我國的綿羊品種資源豐富，擁有很多特有的地方品種資源，因此開展我國綿羊的MHC研究，發(fā)現(xiàn)一些抗病基因，在我國的綿羊抗病育種等領域具有重要的作用。

據(jù)文獻［11］報道，放射性探針的制備包括末端標記，缺口平移及隨機引物等多種方法，而本研究所采用的大片段DNA酶切及末端標記雜交探針的方案。與其他方案相比本方案具有易于操作跟蹤和檢測等優(yōu)點，是一種有效篩選特定區(qū)域基因的方法，但是這種方案對探針的質(zhì)量要求較高。本研究通過GeneQuest軟件分析選擇合適的限制性內(nèi)切酶，酶切減小雜交探針的長度，去除小片段核酸的干擾，準確的定量探針的濃度，制備得到的探針純化后片段大小與預期值相近且分布合理，探針濃度及放射性標記強度均處于可接受范圍內(nèi)?？沙醪脚袛嗬帽狙芯恐蟹椒ㄖ苽涞奶结樂线M一步研究的要求。目前利用這些探針進行的核酸雜交工作正在進行中。

［1］詹勇華，陳創(chuàng)夫，高劍峰，等．中國美利奴細毛羊BAC文庫的質(zhì)量評價［J］．石河子大學學報：自然科學版，2006，24（1）：102－104．

［2］Liu H，Liu K，Wang J，et al．A BAC clone－based physical map of ovine major histocompatibility complex［J］．Genomics．2006，88（1）：88－95．

［3］韓力薇，覃文新，趙新泰，等．以PAC和BAC克隆為探針篩選cDNA 文庫［J］．上海醫(yī)科大學學報，2000，27（6）：449－452．

［4］薩姆布魯克J．分子克隆實驗指南［M］．黃培堂．北京：科學出版社，2002．

［5］Thomson G．HLA disease associations：models for the study of complex human genetic disorders［J］．Crit Rev Clin Lab Sci，1995，32（2）：183－219．

［6］Walter L，Hurt P，Himmelbauer H，et al．Physical mapping of the major histocompatibility complex class II and class III regions of the rat［J］．Immunogenetics，2002，54（4）：268－275．

［7］Kaufman J，Milne S，Gobel T W，et al．The chicken B locus is a minimal essential major histocompatibility complex［J］．Nature，1999，401（6756）：923－925．

［8］Ballingall K T，Ellis S A，Machugh N D，et al．The DY genes of the cattle MHC：expression and comparative analysis of an unusual class II MHC gene pair［J］．Immunogenetics，2004，55（11）：748－755．

［9］賈斌，申紅，余智勇，等．多浪羊和中國美利奴羊 MHCDRB＿1基因多態(tài)性與包蟲病的遺傳易感性［J］．中國人獸共患病學報，2007，23（10）：1004－1005．

［10］彭林澤，袁其彬，郭玉強，等．多浪羊 MHC－DRB1基因的HaeⅢ酶切多態(tài)性［J］．石河子大學學報：自然科學版，2007，25（2）：177－179．

［11］Elvin P，Slynn G，Black D，et al．Isolation of cDNA clones using yeast artificial chromosome probes［J］．Nucleic Acids Res，1990，18（13）：3913－3917．

Preparation of Probes Using the MHC Section BAC Cloning of Sheep

ZOU Yihui，LI Xin，Lifeng，XUE Feng，CHEN Fang，GAO Jianfeng
（College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

In Order to find a way to manufacture probes that could meet the demand of high throughput hybrid screening，restriction enzymes of BseDⅠdigested the 374N21clone of BAC MHC was analysed by using the Gene Quest software．The production of the digestion labeled with32P，Autoradiography detection after being purified by Omega EZNA DNA Probe Purification Kit．The results showed that digestion results were consistent with the software analysis．Purified probes distribution in 0．5～2．0kb．The efficiency of the purification recovery was 60%．The higher quality of probes can satisfy the needs of hybrid screening．

label with32P；sheep；MHC；probe

S826；Q78

A

2009－06－24

國家科技部國際合作重大項目（2006DFB33750）

鄒毅輝（1983－），男，碩士，專業(yè)方向為動物免疫與育種；e－mail：zyh2319731＠163．com。

高劍峰（1964－），男，教授，博士生導師，從事動物免疫與育種研究；e－mail：jianfengg＠shzu．edu．cn。