新疆薔薇紅景天對小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的研究

張珂，李國玉，王航宇，婁猛猛，馮文文，謝石安，王金輝，2

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院／新疆特種植物藥資源重點實驗室，石河子832002；2沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽110016）

新疆薔薇紅景天對小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的研究

張珂1，李國玉1，王航宇1，婁猛猛1，馮文文1，謝石安1，王金輝1，2

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院／新疆特種植物藥資源重點實驗室，石河子832002；2沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽110016）

為研究新疆薔薇紅景天對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。采用0．2%四氯化碳橄欖油溶液按10 mL／kg腹腔注射造模，以血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活性，肝組織中還原性谷胱甘肽（GSH）活性、丙二醛（MDA）含量以及肝組織形態(tài)變化為指標(biāo)，觀察新疆薔薇紅景天對肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果：新疆薔薇紅景天正丁醇萃取物高劑量 （3．0g生藥／kg）組顯著降低小鼠血清AST、ALT活力（P＜0．05）以及肝組織中 MDA含量（P＜0．05）、顯著升高肝組織中GSH活性（P＜0．05）；肝組織變性明顯減輕，肝組織結(jié)構(gòu)比較完好。結(jié)論：薔薇紅景天對小鼠四氯化碳所致小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用。

薔薇紅景天；急性肝損傷；CCl4

薔薇紅景天（Rhodiola rosea L．）為景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola L．）植物。民間多以全草入藥，主要用于清肺止咳、止血、止帶的功效［1］，古代亦用作滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥。研究表明，紅景天可明顯抑制3T3成纖維細(xì)胞增殖［2］；其水煎劑對四氯化碳造成的大鼠急性脂質(zhì)過氧化肝損傷模型具有明顯保護(hù)作用，可使大鼠血清ALT、LDH、CPK以及血漿SOD、血清IPO明顯降低［3－4］；紅景天能阻抑肝細(xì)胞內(nèi)脂褐素的形成，降低酸性磷酸酶活性，抑制大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)血清過氧化物歧化酶活性［5］；紅景天苷對實驗性肝損傷小鼠具有較好的保護(hù)作用［6－7］。

本實驗旨在研究新疆薔薇紅景天對肝細(xì)胞的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)其有效部位，為該藥的臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1．1 試劑與儀器

試劑：谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、丙二醛、還原性谷胱甘肽試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號 分 別 為 20090928、20090928、20091217、20091217；復(fù)方益肝靈片吉林省博維藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，成分為水飛薊和五味子，每片含水飛薊素以水飛薊賓計為21mg，批號：20081201。其余試劑均為分析純。

儀器：Shimadzu UV－2401紫外可見分光光度計（日本島津公司），TG16－WS高速離心機(jī)，（南賽特儀器廠）；Sartorius BS210S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），SK5200HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）等。

1．2 動物

昆明種雄性小鼠72只，體重（20±2）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（新）2003－0001。智能型觸摸屏獨立送回風(fēng)凈化籠IVC飼養(yǎng)（蘇州市蘇杭科技器材有限公司），自由攝食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在（25±1）℃，相對濕度（50±5）%，換風(fēng)次數(shù)為每小時27次，安靜，12h光照周期。

1．3 實驗藥物

新疆石河子市市售的新疆薔薇紅景天（Rhodiola rosea L．）的干燥根莖，由新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院譚勇博士鑒定。標(biāo)本號為No．20071003001，保存在石河子大學(xué)藥學(xué)院。

薔薇紅景天根莖粉碎，以95%乙醇（10、8、8倍量）回流提取3次，每次3h，合并提取液，減壓濃縮成浸膏，浸膏用適量的水分散成混懸液將濃縮后提取物用適量水稀釋，依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將正丁醇萃取物臨用前以生理鹽水混懸，配制成相應(yīng)濃度。

1．4 實驗方法

1．4．1 動物分組及給藥

小鼠CCl4急性肝損傷模型的建立［8］：昆明種雄性小鼠72只隨機(jī)分成6組，正常對照組、陽性對照組、模型組、新疆薔薇紅景天正丁醇萃取物（RRB）低、中、高劑量給藥組分別按生藥量3．0，1．0，0．3g／kg灌胃新疆薔薇紅景天正丁醇萃取物，陽性對照組按水飛薊素0．2g／kg灌胃益肝靈混懸液，正常對照組和模型組等體積灌胃生理鹽水，1次／d，連續(xù)7d，給藥容積為0．2mL／20g；第6d，模型組、陽性對照組及給藥組按10mL／kg腹腔注射0．2%CCl4橄欖油溶液，正常對照組腹腔注射等體積橄欖油，末次給藥1h后除正常組以外，各組小鼠按文獻(xiàn)［9］中的方法ip 0．2%的CCl4橄欖油溶液10mL／kg，禁食不禁水；24h后眼靜脈采血，常規(guī)離心后分離血清測定ALT和AST活力。

引頸處死后迅速解剖，摘取小鼠肝臟，按試劑盒要求制備肝勻漿。從相同部位取肝組織，固定在10%的甲醛溶液中待測。

1．4．2 生化指標(biāo)測定

按試劑盒說明測定小鼠血清AST、ALT活性，肝勻漿中GSH活性、MDA含量，用Shimadzu UV－2401紫外－可見分光光度計比色法測定。

1．4．3 病理觀察

將10%福爾馬林所固定的肝組織石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察其病變。

1．4．4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)均以ˉχ±S表示，所有實驗數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析。

實驗數(shù)據(jù)處理所用分析軟件均為SPSS13．0，P＜0．05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2．1 對血清AST、ALT活性的影響

結(jié)果見表1。

由表1可知：與正常組相比，模型組小鼠血清AST、ALT活力明顯升高，存在顯著性差異（P＜0．05），表明實驗造模成功；與陽性藥益肝靈相比，新疆薔薇紅景天高劑量可使升高的血清AST、ALT活力值下降。

表1 RRB對急性肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響S，n＝12 Tab．1Effect of RRB on the activities of serum ALT and AST in mice

表1 RRB對急性肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響S，n＝12 Tab．1Effect of RRB on the activities of serum ALT and AST in mice

注：與模型組比較，＊表示P＜0．05；與正常組比較，＃＃表示P＜0．01。

組別 劑量／（g／kg） ALT／（U／L） AST／（U／L）51．49±12．45 42．07±8．45模型組 — 331．51±59．91＃＃322．95±26．94＃＃益肝靈 0．2 162．11±42．7＊ 94．96±14．23＊RRBⅠ 0．3 290．80±67．91 311．19±63．26 RRBⅡ 1．0 234．27±27．77 299．98±39．41 RRBⅢ 3．0 173．12±35．20＊ 182．39±19．67正常組 —＊

2．2 對肝組織中GSH活性、MDA含量的影響

結(jié)果見表2。

表2顯示：與正常組相比，模型組肝組織GSH活性明顯降低、MDA含量明顯升高（P＜0．01）表明本實驗造模成功；與模型組相比，新疆薔薇紅景天高可顯著降低肝組織中 MDA含量（P＜0．05），并能使降低的肝組織GSH活性升高。

表2 RRB對急性肝損傷小鼠肝組織GSH和MDA的影響，n＝12Tab．2Effect of RRB on the activities of liver GSH and MDA in mice

表2 RRB對急性肝損傷小鼠肝組織GSH和MDA的影響，n＝12Tab．2Effect of RRB on the activities of liver GSH and MDA in mice

注：與模型組比較，＊表示P＜0．05；與正常組比較，＃表示P＜0．05。

組別 劑量／（g／kg） GSH／（mg／g） MDA／（nmol／mg）2．20±0．43 0．59±0．15模型組 — 1．70±0．08＃ 1．24±0．32＃益肝靈 0．2 1．90±0．59＊ 0．63±0．18＊RRBⅠ 0．3 1．35±0．16 1．18±0．25 RRBⅡ 1．0 2．11±0．34＊ 1．01±0．16 RRBⅢ 3．0 3．46±0．53＊ 0．88±0．15正常組 —＊

2．3 對肝組織病理變化的影響

由圖1可見：HE染色，在光鏡下發(fā)現(xiàn)正常對照組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，結(jié)構(gòu)正常、清晰。CCl4模型組小鼠肝竇及中央靜脈明顯擴(kuò)張，肝細(xì)胞廣泛壞死，細(xì)胞膜不清楚，胞漿液連成一片，病灶區(qū)周圍肝細(xì)胞發(fā)生不同程度的氣球樣變及嗜酸性變，有大量炎性細(xì)胞浸潤，新疆薔薇紅景天高劑量組肝細(xì)胞變性、壞死、炎癥反應(yīng)明顯減輕。新疆薔薇紅景天中劑量組和低劑量組肝細(xì)胞腫脹變性、壞死和炎癥反應(yīng)較四氯化碳組有所改善。

圖1 RRB對急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響Fig．1Effect of RRB on CCl4－induced hepatotoxicity in mice

3 討論

目前，肝病仍是一種發(fā)病率較大而且難以根治的疾病，各種病因以及有毒物質(zhì)所致的肝損傷均可引起細(xì)胞凋亡，并繼發(fā)肝纖維化的病理過程。大量研究表明，在肝細(xì)胞病變過程中，自由基、酶以及脂質(zhì)過氧化等均發(fā)揮重要作用。在正常情況下，生物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和清除維持在一定水平，過多或過少均會給機(jī)體造成損害［10］。四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷動物模型被廣泛應(yīng)用于肝細(xì)胞保護(hù)藥物的研發(fā)中［11－12］。CCl4是一種毒性很強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)入機(jī)體后，在體內(nèi)經(jīng)肝細(xì)胞微粒體內(nèi)細(xì)胞色素P450代謝成三氯甲基自由基和氯自由基，導(dǎo)致肝微粒體的脂質(zhì)過氧化，并在其啟動的過氧化連鎖反應(yīng)中，產(chǎn)生毒性作用更強(qiáng)的二氯甲基自由基及過氧化甲基自由基，自由基產(chǎn)生后會攻擊細(xì)胞膜和膜樣物質(zhì)如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；CCl4同時能抑制內(nèi)源性抗氧化酶（如SOD）活性，致使大量自由基無法清除，加重脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致鈣內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的紊亂，最后引起細(xì)胞凋亡［13－14］，損傷肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致存在于肝細(xì)胞質(zhì)中的可溶性酶AST和ALT釋放入血，因此血清中AST和ALT水平的高低可作為反映肝細(xì)胞受損的敏感性指標(biāo)。GHS是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶類，可清除體內(nèi)過多的自由基，激活或調(diào)動集體中的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，預(yù)防或減輕自由基損傷；MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中不飽和脂肪酸氧化分解釋放出來的反應(yīng)性醛，是脂質(zhì)過氧化的主要降解產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死，因此GSH和MDA的含量的高低可間接反映肝細(xì)胞氧化損傷的程度。

本研究結(jié)果表明，對預(yù)先給予薔薇紅景天正丁醇萃取物，能顯著降低CCl4引起的急性肝損傷后血清中AST和ALT得水平，同時還明顯降低肝組織MDA的含量以及升高肝組織GSH的含量。這些結(jié)果顯示，薔薇紅景天對CCl4所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，可能與增強(qiáng)機(jī)體酶的活力，清除自由基抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低脂質(zhì)過氧化主要產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，提高肝細(xì)胞抗氧化能力，從而拮抗CCl4所引起的膜脂質(zhì)過氧化損傷，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和修復(fù)有關(guān)。同時肝組織病理結(jié)果也驗證了這點。

保肝藥物的作用的主要機(jī)制是通過其抗氧化作用來清除活性氧自由基［15－16］，而薔薇紅景天中富含苯乙醇苷類、苯丙烯醇苷類、黃酮及黃酮苷類和多酚類等具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可清除自由基，這些物質(zhì)對活性氧自由基、超氧自由基、超氧陰離子自由基均有明顯的清除作用，但對于薔薇紅景天對CCl4所制小鼠急性肝損傷的作用機(jī)制有待做更深入的研究。

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Protective Effect of Rhodiola Rosea L．on Liver Injury Induced
by Carbon Tetrachloride in Mice

ZHANG Ke1，LI Guoyu1，WANG Hangyu1，LOU Mengmeng1，F(xiàn)ENG Wenwen1，XIE Shian1，WANG Jinhui1，2
（1School of Pharmacy，Shihezi University／Key Laboratory of Phytomedicine Resources ＆ Modernization of TCM，Shihezi 832002，China；2School of Traditional Chinese Materica Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

To study the protective effect of Rhodiola rosea L．a(chǎn)gainst acute liver injury induced by carbon tetrachloride in mice，the animal model of acute liver injury was established by intraperitoneal injection of 0．2%carbon tetrachloride olive oil 10mL／kg．Alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST）in serum and malondialdehyde（MDA），reduced glutathione hormone（GSH）in liver homogenate were assayed．The histopathological changes of the liver were assayed．The result showed that the nbutanol extract of Rhodiola rosea L．a(chǎn)t an oral dose of 3．0g／kg／day showed a significant hepatoprotective effect relative to the same extent（P＜0．05）by reducing levels of serum aspartate transaminase（AST），alanine transaminase（ALT）and malondialdehyde（MDA）levels，increasing reduced glutathione hormone（GSH）．Degeneration of hepatocytes was obviously prevented in mice treated with Rhodiola rosea L．a(chǎn)nd the liver histological structure was well maintained．Rhodiola rosea L．has protective effect on acute liver injury induced by carbon tetrachloride in mice．

Rhodiola rosea L．；liver injury；CCl4

R963

A

2010－05－30

國家自然科學(xué)基金項目 （30960493），國家重大新藥創(chuàng)制項目（2010ZX09401－304）

張珂（1984－），女，碩士生，專業(yè)方向為天然藥物化學(xué)。

王金輝（1972－），男，教授，從事天然藥物化學(xué)研究；e－mail：wangjh．1972＠vip．sina．com。