利用熒光定量PCR檢測(cè)B．ovis侵染巨噬細(xì)胞RAW264．7的相對(duì)數(shù)量

葛陽春，王遠(yuǎn)志，陳創(chuàng)夫，杜軍偉

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003；2新疆民族與地方高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

利用熒光定量PCR檢測(cè)B．ovis侵染巨噬細(xì)胞RAW264．7的相對(duì)數(shù)量

葛陽春1，2，王遠(yuǎn)志2，陳創(chuàng)夫1，杜軍偉1，2

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003；2新疆民族與地方高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

為了探討布魯氏菌胞內(nèi)寄生的機(jī)制，采用熒光定量PCR方法對(duì)進(jìn)入巨噬細(xì)胞的布魯氏菌的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，克隆了綿羊種布魯氏菌019株的16SrRNA基因和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264．7的GAPDH基因。以16SrRNA基因和巨噬細(xì)胞GAPDH做為內(nèi)參基因，將二者的比值作為檢測(cè)布魯氏菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞數(shù)量多少的指標(biāo)，建立綿羊種布魯氏菌019株侵染巨噬細(xì)胞不同階段的感染模式。結(jié)果表明：在綿羊種布魯氏菌019株侵染巨噬細(xì)胞15min～1h，16SrRNA與GAPDH的比值緩慢上升，侵染1～4h中，16SrRNA與GAPDH的比值急劇上升，說明在此階段，細(xì)菌侵入細(xì)胞中的數(shù)量顯著增多。

綿羊種布魯氏菌019株；巨噬細(xì)胞RAW264．7；熒光定量PCR

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）侵入機(jī)體后引起的變態(tài)反應(yīng)性人畜共患傳染?。?－2］。該病廣泛分布于世界各地，在許多國家都有不同程度的流行。人的感染此病主要來自染疫的家畜，病期可長達(dá)數(shù)月、數(shù)年，甚至幾十年，嚴(yán)重時(shí)可致殘，喪失勞動(dòng)能力［3］。家畜患布病后出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、不孕、乳腺炎和睪丸炎等，可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［4］，嚴(yán)重影響著畜牧業(yè)發(fā)展［5］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，綿羊種布魯氏菌是嚴(yán)重危害新疆畜牧業(yè)發(fā)展和農(nóng)牧民健康的病原之一［6］。

布魯氏菌是兼性胞內(nèi)寄生菌，主要定居在巨噬細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞這兩類宿主細(xì)胞。在感染早期，吞噬泡中絕大多數(shù)布魯氏菌被巨噬細(xì)胞殺死［7－8］。隨后存有少量活菌的吞噬泡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)持續(xù)相互作用，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)制小體或布氏小體，此時(shí)存活的布魯氏菌能夠抵抗巨噬細(xì)胞的再次攻擊，進(jìn)而在巨噬細(xì)胞中快速繁殖，此外，布魯氏菌的某些蛋白可抑制巨噬細(xì)胞的凋亡［7］，可避免巨噬細(xì)胞死亡崩解后，使布魯氏菌再次面對(duì)機(jī)體免疫和細(xì)胞免疫的不利環(huán)境，從而保護(hù)布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的長期生存，成為布病慢性感染的重要原因之一。

本試驗(yàn)以綿羊種布魯氏菌019株16SrRNA基因和巨噬細(xì)胞GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，建立019株侵染巨噬細(xì)胞感染模型，在感染15min、30min、1h、4 h后，用熒光定量PCR檢測(cè)胞內(nèi)菌16SrRNA與侵染細(xì)胞GAPDH相對(duì)數(shù)量，進(jìn)而分析在感染不同階段布魯氏菌胞內(nèi)寄生數(shù)量的變化，為進(jìn)一步研究布魯氏菌的入侵模式和胞內(nèi)定位奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細(xì)胞和菌株

細(xì)胞：小鼠巨噬細(xì)胞RAW264．7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；菌株：綿羊種布魯氏菌019株和大腸桿菌DH5a由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1．1．2 主要試劑

DMEM干粉和小牛血清為GIBCO產(chǎn)品，質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、T4DNA連接酶、pGM－T、DNA Marker購自天根生物技術(shù)有限公司，熒光定量PCR試劑盒購自晶芯生物有限公司，布魯氏菌固體和液體培養(yǎng)基購自美國BD公司，Trizol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 16SrRNA基因和GAPDH基因?qū)崟r(shí)定量引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)Primer－3在線生物軟件針對(duì)綿羊種布魯氏菌019株16SrRNA基因和小鼠巨噬細(xì)胞GAPDH基因設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物，擴(kuò)增長度分別為159bp和163bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，濃度10D／管，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物設(shè)計(jì)Tab．1Primer sequences for real－time PCR

1．2．2 16SrRNA基因和GAPDH基因的克隆

1．2．2．1 細(xì)菌16SrRNA基因的克隆

收集綿羊種布魯氏菌019株，以85℃滅活30 min的該菌株為模板擴(kuò)增16SrRNA基因。取滅活的019株菌液1μL，10×PCR buffer 2μL，2．5 mmol／L dNTP 0．8μL，引物 P1（25μmol／L）、P2（25μmol／L）各0．4μL，雙蒸水14．3μL，Taq plus DNA聚合酶0．3μL（5U／μL）混勻。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4min，95℃50s，64℃50s，72℃50s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將PCR陽性條帶回收，連于克隆載體pGM－T后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1．2．2．2 細(xì)胞GAPDH 基因的克隆

用Trizol試劑盒提取小鼠巨噬細(xì)胞總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，10×PCR buffer 2．0μL，2．5mmol／L dNTP 0．8 μL，引物P3（25μmol／L）、P4（25μmol／L）各0．4 μL，雙蒸水14．3μL，Taq plus DNA聚合酶0．3μL（5．0U／μL）混勻。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃50s，58℃50s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)將PCR陽性條帶回收，連于克隆載體pGM－T后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1．2．3 16SrRNA和GAPDH基因熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將測(cè)序正確的陽性克隆重新?lián)u菌后提取質(zhì)粒，建立10－2～10－8的6個(gè)拷貝數(shù)的100倍梯度稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．4 綿羊種布魯氏菌019株侵染RAW264．7巨噬細(xì)胞試驗(yàn)

1．2．4．1 綿羊種布魯氏菌019株的計(jì)數(shù)

將綿羊種布魯氏菌019株保存的凍干菌接種于布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基上，置于CO2培養(yǎng)箱，37℃，10%CO2培養(yǎng)4d，挑取單菌落，接種于布魯氏菌斜面培養(yǎng)基上再培養(yǎng)3d，加入2mL生理鹽水，用接種針輕輕將斜面培養(yǎng)基上的細(xì)菌刮下，以10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9、10－10、10－11、10－12、10－13、10－14、10－15均勻稀釋 細(xì)菌，并取200μL 10－12、10－13、10－14、10－15稀釋菌液涂布于120mm含有10%小牛血清肝瓊脂培養(yǎng)基的平板中，每一稀釋度涂2個(gè)平板，置于10%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。

1．2．4．2 綿羊種布魯氏菌019株在不同的時(shí)間段侵染RAW264．7巨噬細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264．7用含10%DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)（加青霉素、鏈霉素），在細(xì)胞長到對(duì)數(shù)生長期時(shí)將RAW264．7置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

培養(yǎng)48h后，用不含抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)液換液，計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，用新鮮培養(yǎng)的綿羊種布魯氏菌019株按細(xì)菌：細(xì)胞50∶1的比例進(jìn)行侵染，并將侵染的小鼠巨噬細(xì)胞繼續(xù)置于5%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)15min、30min、1h、4h后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，將留在胞外的細(xì)菌洗掉，收集侵染細(xì)胞，提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，以建立的1．2．3中的方法進(jìn)行細(xì)菌16SrRNA和細(xì)胞GAPDH基因的熒光定量的檢測(cè)。

2 結(jié)果

2．1 布魯氏菌16SrRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

用引物P1和P2對(duì)綿羊種布魯氏菌019株進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，可得到159bp的核酸片段（圖1）。

圖1 16SrRNA基因的擴(kuò)增Fig．1PCR amplification of 16SrRNA

2．2 巨噬細(xì)胞GAPDH基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

用Trizol提取小鼠巨噬細(xì)胞總RNA，經(jīng)電泳檢測(cè)條帶明亮清晰，無降解現(xiàn)象。用引物P3和P4對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，可得到163bp的核酸片段，與預(yù)期的一致（圖2）。

圖2 GAPDH基因的擴(kuò)增Fig．2PCR amplification of GAPDH

2．3 布魯氏菌16SrRNA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

16SrRNA基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

上式中，相關(guān)系數(shù)為0．997，基因的擴(kuò)增效率為69，擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線Tm值為86．3～87．2（圖3）。

圖3 16SrRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線、溶解曲線Fig．3Standard curve and melting curve of 16SrRNA gene

2．4 巨噬細(xì)胞GAPDH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：上式中，相關(guān)系數(shù)為0．996，基因的擴(kuò)增效率為66，擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線只有1個(gè)峰值，Tm值為87．6（圖4）。

圖4 GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線、溶解曲線Fig．4Standard curve and melting curve of GAPDH gene

2．5 綿羊種布魯氏菌019株侵染RAW264．7細(xì)胞cDNA的檢測(cè)結(jié)果

綿羊種布魯氏菌019株在15min、30min、1h、4h時(shí)間段分別侵染轉(zhuǎn)染了巨噬細(xì)胞RAW264．7后，收集被不同時(shí)間段侵染的細(xì)胞，提取細(xì)胞總的RNA，反轉(zhuǎn)錄后以GAPDH的引物進(jìn)行常規(guī)PCR對(duì)cDNA的檢測(cè)，結(jié)果見圖5。

圖5 GAPDH基因的擴(kuò)增Fig．5PCR amplification of GAPDH

2．6 綿羊種布魯氏菌019株侵染RAW264．7細(xì)胞熒光定量的檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果見圖6。

圖6 綿羊種布魯氏菌019株在侵染過程中的相對(duì)表達(dá)量Fig．6Expression of Brucella ovis 019strain during the infection

用布魯氏菌16SrRNA的數(shù)量／巨噬細(xì)胞GAPDH的數(shù)量的比值作為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果（圖6）表明在綿羊種布魯氏菌019株侵染巨噬細(xì)胞15min～1h，16SrRNA與GAPDH的比值緩慢上升，在侵染1h～4h，16SrRNA與GAPDH的比值急劇上升，說明在此階段，細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞中的數(shù)量顯著增多。

3 結(jié)論

布魯氏菌病是由布魯氏菌屬的細(xì)菌引起的人畜共患傳染?。?］。布魯氏菌感染滋養(yǎng)層細(xì)胞，使胎兒胎盤與母體胎盤分離，從而導(dǎo)致流產(chǎn)［10］；布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞，并在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存、繁殖，從而引起布魯氏菌病的慢性感染和反復(fù)發(fā)作［5］。布魯氏菌感染宿主細(xì)胞需經(jīng)過四步：黏附、侵入、定植和傳播［11］。布魯氏菌胞內(nèi)寄生數(shù)量與其感染階段有關(guān)。當(dāng)前菌落形成單位（CFU）是胞內(nèi)布魯氏菌計(jì)數(shù)方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”［12］。該方法是建立在布魯氏菌培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，操作危險(xiǎn)、復(fù)雜、耗時(shí)。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR［13］以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)被廣大研究者青睞。

本研究結(jié)合熒光定量PCR實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)監(jiān)測(cè)、靈敏度高等特點(diǎn)，分別以布魯氏菌豐度保守的16S rRNA和巨噬細(xì)胞表達(dá)恒定的GAPDH基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過熒光定量PCR的方法繪制了2個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在綿羊種布魯氏菌019株侵染巨噬細(xì)胞的15min、30min、1h、4h時(shí)收集細(xì)胞，將細(xì)菌16SrRNA基因和細(xì)胞GAPDH基因二者的比值作為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行侵染前后的比較，結(jié)果表明，在感染階段屬于黏附期，16SrRNA與GAPDH的比值緩慢上升；在感染階段屬于侵入期，16SrRNA與GAPDH的比值急劇上升，該結(jié)論與 Watarai等［14］的報(bào)道一致。本研究后期用CFU驗(yàn)證熒光定量PCR的結(jié)果，在布魯氏菌感染的1～4h，胞內(nèi)布魯氏菌數(shù)量較15～30min的數(shù)量明顯增多，這間接說明了熒光定量PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性。

［1］張紅星，陳創(chuàng)夫，王遠(yuǎn)志，等．羊種布魯氏菌 M5－90 OMP31蛋白原核表達(dá)［J］．石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版版，2009，27（5）：593－596．

［2］劉輝，陳創(chuàng)夫，許程建，等．新疆綿羊種布魯氏菌Gro EL基因的克隆及序列分析［J］．石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版版，2005，23（6）：683－686．

［3］Claire E Dawson，Emma J Stubberfield，Lorraine L Perrett．Phenotypic and molecular characterisation of Brucella isolates from marine mammals［J］．BMC Microbiology，2008，8：224．

［4］唐利燕，陳創(chuàng)夫，王遠(yuǎn)志，等．布魯氏菌bp26基因的原核表達(dá)及BP26－間接ELISA方法的初步建立［J］．石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，27（4）：437－440．

［5］Pappas G，Papadimitriou P，Akritidis N，et al．The new global map of human brucellosis［J］．Lancet Infect Dis，2006，6（9）：538－541．

［6］王茂武，宮新生，尚德秋．市場經(jīng)濟(jì)下布魯氏菌病防治工作的新思路［J］．疾病監(jiān)測(cè)，2004，19（8）：306－308．

［7］He Y，Reichow S，Ramamoorthy S，et al．Brucella melitensis triggers time－dependent modulation of apoptosis and downregulation of mitochondrion－associated gene expression in mouse macrophages［J］．Infect Immun，2006，74（9）：5035－5046．

［8］Jimenez de Bagues，Maria Pilar，Sherri Dudal，et al．Cellular bioterrorism：how Brucella corrupts macrophage physiology to promote invasion and proliferation［J］．Clin Immun，2005，114：227－238．

［9］Young E J．An overview of human brucellosis［J］．Clin Infect Dis，1995，21：283－289．

［10］Suk Kim，Dong Soo Lee，Kenta Watanabe，et al．Interferonγpromotes abortion due to Brucella infection in pregnant mice［J］．BMC Microbiology，2005，5（22）：1471－1481．

［11］Elias Barquero Calvo，Esteban Chaves Olarte1，David S Weiss，et al．Brucella abortus uses a stealthy strategy to avoid activation of the innate immune system during the onset of infection［J］．PLoS ONE，2007，7：1－14．

［12］Pascaline Fontes，Maria Teresa Alvarez Martinez，Antoine Gross，et al．Absence of evidence for the participation of the macrophage cellular prion protein in infection with Brucella suis［J］．Infec and Immun，2005，73（10）：6229－6236．

［13］張馳宇，成婧，李全雙，等．熒光實(shí)時(shí)定量PCR的研究進(jìn)展［J］．江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2006，16（3）：268－270．

［14］Watarai M，Makino S，F(xiàn)ujii Y，et al．Modulation of Brucella－induced macropinocytosis by lipid rafts mediates intracellular replication［J］．Cell Microbiol，2002，4（6）：341－355．

Detection of Comparative Quantity of Brucella ovis during the Infected RAW264．7Macrophage by Real－Time PCR

GE Yangchun1，2，WANG Yuanzhi2，CHEN chuangfu1，DU Junwei1，2
（1College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003，China；2Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease，Shihezi 832003，China）

To study and research brucella intracellular parasitism mechanism．The test detect the number of intracellular brucellas were described by real－time PCR．Two genes，including B．ovis 019strain 16SrRNA and mouse RAW264．7macrophage GAPDH genes，were cloned．Standard curve of two objective genes were described．The infection model of Brucella invading macrophage was built at different stages．The ratio between B．ovis 019strain 16SrRNA and mouse RAW264．7macrophage GAPDH genes was detected．The results showed the ratio between 16SrRNA and GAPDH slowly rised during 15min－1hafter infection．However，the ratio rapidly rised during 1～4h，which conveyed us the number of intracellular pathogen was significantly enhanced．

Brucella ovis 019strain；RAW264．7macrophage；real－time PCR

S852．65

A

2010－04－06

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973）項(xiàng)目（2010CB530200），國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30800813），新疆兵團(tuán)博士基金（2009JC15）。

葛陽春（1983－），女，碩士生，專業(yè)方向?yàn)閯?dòng)物疾病病理學(xué)。

王遠(yuǎn)志（1977－），男，副教授，從事免疫遺傳與抗病機(jī)制研究；wyzshz＠sina．com。