六味地黃方超微飲片含藥血清對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞的影響

肖子曾 ，趙 婧 ，戴 冰 *，冷 旺 ，梅 君 ，李興豐

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生班，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

六味地黃方是臨床療效非常顯著的滋陰補(bǔ)腎的經(jīng)典名方，被后人譽(yù)為“補(bǔ)陰方藥之祖”。近年來，對(duì)于六味地黃方體外試驗(yàn)的報(bào)道甚多，但對(duì)于該方的體內(nèi)試驗(yàn)相對(duì)較少。六味地黃方被制成多種劑型，除了傳統(tǒng)的丸劑及湯劑，還有顆粒劑和超微飲片。超微飲片作為一種新劑型，以其節(jié)省藥材、方便衛(wèi)生的特點(diǎn)已被眾多患者所接受[1]，而對(duì)于六味地黃方超微飲片的體內(nèi)作用如何，報(bào)道甚少。有研究表明口服六味地黃湯能明顯降低實(shí)驗(yàn)性高血脂大鼠總膽固醇和肝中脂肪含量[2]，提示其對(duì)脂肪細(xì)胞的增殖、分化可能有一定影響。為觀察六味地黃方超微飲片對(duì)脂肪細(xì)胞的增殖、分化究竟有無影響，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 20只健康Wistar大鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量 （200±20）g；由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第20-002號(hào)。

1.1.2 藥物 六味地黃方超微飲片：熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓超微飲片 （湖南春光中藥飲片公司，批號(hào)：050512）

1.1.3 試劑 地塞米松(批號(hào) 123K06612)，胰島素(批號(hào)024K1188)，含酚紅 DMEM低糖培養(yǎng)基(批號(hào)123K83031)，磷酸二羥丙酮(批號(hào)027K1635),上述試劑均購自Sigma公司；MTT(批號(hào)1313Bl1)購自Amresco公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(批號(hào)20050617)購自蘭州民海生物工程有限公司；油紅0(批號(hào)830120)購自北京夏新試劑分裝廠；DMSO購自宜興市化工廠；雙蒸水；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 六味地黃方超微飲片灌胃溶液的制備 六味地黃方各單味藥材超微飲片按比例 （熟地黃∶山茱萸∶山藥∶丹皮∶澤瀉∶茯苓=8∶4∶4∶3∶3∶3）混合共 75 g，加水至 450 mL 使其充分溶解，放置20 min后過濾，將濾液濃縮至含生藥為2 g/mL。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 將健康Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、六味地黃方超微飲片2組，每組10只，雌雄各半，禁食12 h（自由飲水）。給予空白對(duì)照組生理鹽水、六味地黃方超微飲片組按照每次30 g/kg（以生藥材含量計(jì)）劑量（即1.5 mL/100 g。藥物劑量按照60 kg成人體表面積換算），分別給予大鼠灌胃，1次/d，連續(xù)3 d。

1.2.3 空白及含藥血清制備 上述各組大鼠于第3天最后1次灌胃1 h后,用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)肝門靜脈取血5 mL，靜置4 h，1 500 r/min離心30 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 大鼠前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng) 取雄性大鼠腹股溝部純凈脂肪顆粒，pH 7.2緩沖生理鹽水 (PBS)洗滌后剪成0.5～l mm3大小均勻的小顆粒，以1 000 r/min離心10 min取上層的純脂肪顆粒，輕輕鋪于經(jīng)培養(yǎng)液潤濕的培養(yǎng)瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM/低糖培養(yǎng)液5～10 mL，塞緊瓶塞，將底面翻轉(zhuǎn)朝上。37℃、5%C02培養(yǎng)1～2 h，待粘附牢固后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶做正常培養(yǎng)每日觀察。原代培養(yǎng)區(qū)域性單層匯合達(dá)到約1/2瓶底面積后即可傳代，取培養(yǎng)7代以內(nèi)的大鼠前脂肪細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[3]。

1.2.5 按馬瑾瑜等[4]的方法測定 可見前脂肪細(xì)胞約在第2.5天時(shí)數(shù)量增加到20 000，在第9天前細(xì)胞基本呈現(xiàn)等比增長，其倍增時(shí)間約為2.5 d左右。

1.2.6 酶組織化學(xué)提取法測定大鼠前脂肪細(xì)胞分化過程中的標(biāo)志物甘油磷酸脫氫酶(GPDH)動(dòng)態(tài)變化 根據(jù)Stuart等[5]的方法進(jìn)行測定，傳代細(xì)胞形成單層匯合后，在胰島素10 μmol/L和地塞米松1 μmol/L的作用下即開始上升并迅速增加，10 d左右到達(dá)高峰并維持在高水平。形態(tài)上表現(xiàn)為單層匯合1周后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴。

1.2.7 油紅O染色提取法測定脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪含量 用PBS沖洗2～3次，加入10%的甲醛緩沖液室溫下固定1 h，去固定液，加入油紅O染色，室溫下染色2 h，去染色劑，以無菌雙蒸水沖洗2次，洗去未著色的染料，倒置顯微鏡下觀察，照相。結(jié)束后，以異丙醇溶解，490 nm酶標(biāo)儀下測吸光度，則可見前脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量在單層形成6～7 d后迅速增加，11 d左右到達(dá)高峰，與形態(tài)學(xué)上的單層匯合后1周左右細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪顆粒完全吻合。細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的增加比GPDH的出現(xiàn)要晚約6 d左右。說明酶的出現(xiàn)在先，脂肪出現(xiàn)在后。

1.2.8 細(xì)胞分組及給藥 將第四代的大鼠前脂肪細(xì)胞接種到96孔板，貼壁后于96孔培養(yǎng)板每6孔一組，分為4組：空白對(duì)照組（含10%空白大鼠血清），六味地黃方超微飲片含藥血清高、中、低劑量組 （濃度分別為10%、5%、2.5%，簡稱超微高、中、低劑量組），上述各組所含血清的終濃度均為10%，含藥血清含量不足者以空白大鼠血清補(bǔ)齊。

1.2.9 六味地黃方超微飲片對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞增殖的影響 配制大鼠前脂肪細(xì)胞增殖培養(yǎng)液:DMEM/低糖+空白大鼠血清,分別與六味地黃方超微飲片含藥血清共同溶解于培養(yǎng)液中,其終濃度同“1.2.8”項(xiàng)。取第四代的大鼠前脂肪細(xì)胞以10 000個(gè)/孔接入96孔培養(yǎng)板中,37℃5%C02培養(yǎng)12 h，分別加入上述配制的各種含藥培養(yǎng)液,再培養(yǎng)48 h，將濃度為5 g/L MTT液與10%空白大鼠血清的DMEM培養(yǎng)液按體積1∶9配成MTT培養(yǎng)液,移出培養(yǎng)液,換上MTT培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h，吸干培養(yǎng)液,每孔加100 μL DMSO混勻后置酶標(biāo)儀490 nm觀測吸光度值,觀察各濃度含藥血清對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖的影響，測定并記錄各孔吸光度(A值)，6復(fù)孔取平均值。

1.2.10 六味地黃方超微飲片對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞分化過程中甘油磷酸脫氫酶(GPDH)的影響 配制大鼠前脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)液：DMEM/低糖+空白大鼠血清+胰島素10 μmol/L+地塞米松1 μmol/L.以分化培養(yǎng)液配制不同濃度六味地黃方超微飲片含藥血清培養(yǎng)液，其終濃度同“1.2.8”項(xiàng)。取第四代的細(xì)胞以30 000個(gè)/孔接種入96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)5 d，分別加入上述配制的各培養(yǎng)液，再培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)結(jié)束后,酶組織化學(xué)提取法測定GPDH的活性，紫外分光光度計(jì)340 nm波長處觀測吸光度值，實(shí)驗(yàn)以吸光度（A值）間接表示酶的活性，測定并記錄各孔吸光度(A值)，6復(fù)孔取平均值。

1.2.11 六味地黃方超微飲片對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪積聚的影響 取第四代的大鼠前脂肪細(xì)胞以30 000細(xì)胞/孔接種入96孔培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)10 d后，加入“1.2.10”配制好的含藥培養(yǎng)液，再于同樣條件下培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)結(jié)束后,細(xì)胞用10%的甲醛固定1 h，用油紅O工作液(2 g/L)染色2 h，用雙蒸水充分洗凈，培養(yǎng)板放入37℃溫箱使殘余水分蒸發(fā)，用異丙醇溶解細(xì)胞內(nèi)油紅O，置酶標(biāo)儀510 nm觀測吸光度(A值)，記錄各孔吸光度(A值)，6復(fù)孔取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“±s”表示，t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃方超微飲片對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞增殖、分化過程中甘油磷酸脫氫酶（GPDH）的影響

六味地黃方超微飲片含藥血清對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞增殖的影響中10.0%、5.0%、2.5%濃度的六味地黃方超微飲片含藥血清與空白血清比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。六味地黃方超微飲片含藥血清對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞分化過程GPDH的影響中10.0%、5.0%濃度的六味地黃方超微飲片含藥血清與空白血清比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2.5%的六味地黃方超微飲片含藥血清與空白血清比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示六味地黃方超微飲片對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，其它各組比較，其增殖A值隨濃度增大而升高。對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞分化過程中GPDH的升高有抑制作用，且在高濃度時(shí)抑制作用最強(qiáng)。見表1。

表1 六味地黃方超微飲片含藥血清對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞增殖、分化過程中GPDH的影響 （n=6，±s）

表1 六味地黃方超微飲片含藥血清對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞增殖、分化過程中GPDH的影響 （n=6，±s）

注：與空白對(duì)照組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別空白對(duì)照組超微高劑量組超微中劑量組超微低劑量組含藥血清濃度（%）—10.0 5.0 2.5增殖(A值)0.22±0.031 0.42±0.056△△0.35±0.045△△0.28±0.044△分化GPDH(A值)0.55±0.093 0.35±0.074△△0.43±0.057△0.50±0.045

2.2 六味地黃方超微飲片對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪積聚的影響

六味地黃方超微飲片含藥血清對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪積聚的影響中,10.0%、5.0%濃度的六味地黃方超微飲片含藥血清與空白血清比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示六味地黃方超微飲片高、中劑量組對(duì)分化過程中脂肪積聚均有抑制作用，但低劑量組無此作用。見表 2。

表2 六味地黃方超微飲片含藥血清對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪積聚的影響 （n=6，±s）

表2 六味地黃方超微飲片含藥血清對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪積聚的影響 （n=6，±s）

注：與空白對(duì)照組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

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3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明六味地黃方超微飲片對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，對(duì)其分化過程中的脂肪分解具有抑制作用，從而減少游離脂肪酸的排放，減少脂肪顆粒的積聚，提示此作用可能為六味地黃丸治療脂肪肝、糖尿病等代謝性疾病的機(jī)制之一。對(duì)研究六味地黃方在臨床糖尿病、糖耐量異常、高血壓、高血脂及動(dòng)脈粥樣硬化等代謝性疾病[5]的治療機(jī)制有很好的促進(jìn)作用。

中藥超微飲片具有質(zhì)量可控、安全有效、服用方便、節(jié)省藥材的優(yōu)勢。中醫(yī)超微飲片實(shí)施大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，為近年中藥現(xiàn)代化研究的一個(gè)熱點(diǎn)。本研究在參考有關(guān)方法的基礎(chǔ)上，將單味藥材超微飲片按比例混合，給大鼠灌胃，取其含藥血清，以大鼠前脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察六味地黃方超微飲片含藥血清對(duì)脂肪細(xì)胞增殖、分化的影響[6]。研究發(fā)現(xiàn)，該作用與藥物的血清濃度高、低有關(guān)，但其機(jī)制如何？且與其湯、丸相比對(duì)脂肪細(xì)胞增殖、分化作用有何差異；同時(shí)該藥物的含藥血漿有無此作用，還有待進(jìn)一步研究。

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