電融合法產(chǎn)生駱駝刺與鷹嘴紫云英屬間體細(xì)胞雜種

張改娜，賈敬芬，孔祥生，胥華偉

1 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，洛陽 471003

2 西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 陜西省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710069

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

電融合法產(chǎn)生駱駝刺與鷹嘴紫云英屬間體細(xì)胞雜種

張改娜1,2，賈敬芬2，孔祥生1，胥華偉1

1 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，洛陽 471003

2 西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 陜西省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710069

采用電融合法獲得了駱駝刺和鷹嘴紫云英屬間體細(xì)胞雜種。駱駝刺原生質(zhì)體來自發(fā)根農(nóng)桿菌A4轉(zhuǎn)化系細(xì)胞，并經(jīng)碘乙酰胺處理；鷹嘴紫云英原生質(zhì)體從甲硫氨酸抗性系細(xì)胞分離。雙親及同源融合產(chǎn)物均不能在無激素的篩選培養(yǎng)基上持續(xù)分裂，融合后的雜種細(xì)胞由于雙親生理互補(bǔ)效應(yīng)可恢復(fù)持續(xù)分裂能力而被篩選出來。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了電融合參數(shù)，如直流脈沖、交流脈沖和脈沖次數(shù)。融合產(chǎn)物經(jīng)培養(yǎng)獲得的雜種細(xì)胞系經(jīng)形態(tài)學(xué)、染色體數(shù)目檢查、生化及隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析，鑒定出10個(gè)雜種克隆，并從3個(gè)雜種克隆再生了小植株。

駱駝刺，鷹嘴紫云英，體細(xì)胞雜交

Abstract:We obtained intergenus somatic hybrid betweenAlhagi pseudalhagiandAstragalus cicerby using electroporation.Agrobacterium rhizogenesA4-transformedA. pseudalhagiprotoplasts were treated with iodoacetamide so that they were unable to sustain divisions.A. cicerprotoplasts were isolated from a methionine-resistant mutant and did not survive in the medium without plant growth regulator. The intergenus somatic hybrid cells were selected based on physiological complementation between the two parents. We optimized some parameters of electroporation, such as direct current impulse, alternating current impulse and the impulse number. We identified ten hybrid clones by morphological observation, checking the chromosome numbers, isoenzyme analysis and random amplified polymorphic DNA analysis, and obtained regenerated plantlets from three hybrid clones.

Keywords:Alhagi pseudal hagi,Astragalus cicerL., somatic hybridiation

通過原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)產(chǎn)生體細(xì)胞雜種是克服有性不親和性、實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣遺傳重組、轉(zhuǎn)移多基因控制性狀的可行途徑。植物體細(xì)胞雜交是植物生物技術(shù)的重要組成部分。隨著技術(shù)手段的不斷改進(jìn)，在植物種內(nèi)、種間、屬間甚至科間的原生質(zhì)體融合都已成功。有一些優(yōu)良的性狀，特別是野生種的抗病[1]、抗旱[2]和胞質(zhì)雄性不育[3]等性狀已通過體細(xì)胞雜交成功地轉(zhuǎn)移到栽培植物中。植物的抗逆性多為多基因控制，較之轉(zhuǎn)基因技術(shù)，體細(xì)胞雜交在提高植物抗逆性方面有一定的優(yōu)勢。誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用化學(xué)方法和電融合方法。電融合是通過外電場交流脈沖收集細(xì)胞排列成串，然后施加直流高壓脈沖造成細(xì)胞膜的可逆擊穿，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合，較之化學(xué)融合有操作簡便、易于控制、副作用小、融合率高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。從20世紀(jì)80年代中期起，國外對動(dòng)植物細(xì)胞電融合的方法和條件進(jìn)行了大量研究[4-6]。本研究采用電融合法誘導(dǎo)駱駝刺Alhagi pseudoalhagiA4轉(zhuǎn)化系 (簡稱ApA4) 和鷹嘴紫云英Astragalus cicer甲硫氨酸抗性系 (簡稱 Acmetr) 之間的原生質(zhì)體融合。鷹嘴紫云英是多年生豆科牧草，也是一種蛋白質(zhì)含量豐富、草質(zhì)和適口性都極好的飼草作物，但缺乏含硫氨基酸[7]。動(dòng)物毛發(fā)是由一種不溶的纖維狀蛋白——α-角蛋白構(gòu)成的，α-角蛋白含有豐富的含硫氨基酸——胱氨酸[8]，所以飼料的營養(yǎng)成分中含硫氨基酸對動(dòng)物毛發(fā)的產(chǎn)量和品質(zhì)有較大的影響。本實(shí)驗(yàn)室已建立了含硫氨基酸含量較高的鷹嘴紫云英甲硫氨酸抗性系。駱駝刺是沙漠地區(qū)生長的半灌木豆科植物，具有很強(qiáng)的抗旱、抗風(fēng)沙和固土能力，可作為土壤水資源的指示植物[9]。本研究欲通過原生質(zhì)體融合技術(shù)建立這兩種植物屬間體細(xì)胞雜交的實(shí)驗(yàn)體系，探索開發(fā)利用沙漠植物遺傳資源和將沙漠植物抗旱性狀引入離體遺傳操作的新途徑。

1 材料和方法

1.1 駱駝刺原生質(zhì)體來源

駱駝刺原生質(zhì)體來自本實(shí)驗(yàn)室駱駝刺 A4轉(zhuǎn)化系毛根誘導(dǎo)的愈傷組織，具有激素自主性。原生質(zhì)體制備參考文獻(xiàn)[10]。

1.2 鷹嘴紫云英原生質(zhì)體來源

鷹嘴紫云英原生質(zhì)體來自本實(shí)驗(yàn)室鷹嘴紫云英甲硫氨酸抗性系愈傷組織，不具備激素自主性。原生質(zhì)體制備參考文獻(xiàn)[11]。

1.3 駱駝刺原生質(zhì)體的處理

在 4℃、黑暗條件下，分別用 1.0、2.0、5.0、10.0 mmol/L不同濃度的碘乙酰胺 (IOA，配于CPW9M[12]中) 處理ApA4原生質(zhì)體10 min，之后離心收集原生質(zhì)體，用 CaCl2洗滌液 (0.16 mmol/L CaCl2+0.1% MES，pH 5.8) 沖洗2次，并懸浮于其中備用。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.4 儀器

電融合儀 (德國 Eppendorf公司)，融合室型號為4308 030.003和4308 014.008，電極間距為200 μm，電融合槽容量分別為0.2 mL和0.6 mL。

1.5 雙親原生質(zhì)體融合條件的優(yōu)化

電融合液為0.7 mol/L的甘露醇+0.25 mmol/L氯化鈣+0.03%的MES，pH 5.8。將純化的2種原生質(zhì)體分別用電融合液洗滌 2遍，然后密度調(diào)至1.0×106個(gè)/mL、3×105個(gè)/mL、1.0×105個(gè)/mL 三個(gè)濃度，每個(gè)濃度等體積混合。吸取混合液均勻分布于電融合槽中，靜置1 min，在125 V/cm的交流脈沖 (AC) 下選擇隊(duì)列時(shí)間。

在原生質(zhì)體密度一定條件下，改變AC，觀察原生質(zhì)體的形狀和形成串珠的長度，以確定最佳 AC和隊(duì)列時(shí)間。

在密度、AC和隊(duì)列時(shí)間最佳條件下，以脈沖次數(shù)為 2，觀察原生質(zhì)體融合頻率，獲得最佳直流脈沖 (DC) 和幅寬；并以其他參數(shù)在最佳條件下驗(yàn)證脈沖次數(shù)和甘露醇濃度對原生質(zhì)體融合頻率的影響。融合過程中用倒置顯微鏡 (型號：ECLIPSE TE2000-S) 觀察和照相。每個(gè)處理重復(fù)3次。

用Acmetr原生質(zhì)體和 IOA處理的有一定存活率，但不能持續(xù)分裂的ApA4原生質(zhì)體的進(jìn)行融合，分別單獨(dú)培養(yǎng)雙親原生質(zhì)體及混合原生質(zhì)體作為對照。

1.6 雜種融合細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)

Acmetr原生質(zhì)體在無激素條件下不能分裂，ApA4原生質(zhì)體經(jīng)IOA處理，胞質(zhì)失活不能分裂。雙親及同源融合產(chǎn)物均不能在無激素的篩選培養(yǎng)基上持續(xù)分裂而死亡，融合后雜種細(xì)胞由于生理互補(bǔ)恢復(fù)持續(xù)分裂能力而被篩選出來。

根據(jù)駱駝刺和鷹嘴紫云英原生質(zhì)體培養(yǎng)的最佳條件，融合細(xì)胞培養(yǎng)采用附加有2.0 mg/L 2,4-D、0.2 mg/L 6-BA、500 mg/L水解乳蛋白、0.3 mol/L甘露醇和2%蔗糖的DPD液體培養(yǎng)基淺層培養(yǎng)。培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[13]。將在淺層培養(yǎng)基中形成的肉眼可見的小愈傷組織轉(zhuǎn)入附加0.35%瓊脂糖的DPD半固體選擇培養(yǎng)基和附加有 0.65%瓊脂粉的MS基本培養(yǎng)基中連續(xù)篩選。篩選出的雜種細(xì)胞擴(kuò)增后放入附加有1 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA的 MS固體培養(yǎng)基中分化。

1.7 再生愈傷組織的鑒定

1.7.1形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和同工酶分析

將融合再生愈傷組織的色澤、顆粒大小等與雙親愈傷組織進(jìn)行比較，作為細(xì)胞雜種鑒定的參考。

挑取生長旺盛的雙親及融合細(xì)胞再生的愈傷組織進(jìn)行低溫預(yù)處理，壓片法[14]制片，卡寶品紅染色，Olympus BH-2型研究用顯微鏡觀察記錄。

取融合細(xì)胞再生愈傷組織及雙親愈傷組織做過氧化物酶同工酶分析，方法同文獻(xiàn)[14]。

1.7.2RAPD分析

方法同文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 IOA預(yù)處理對駱駝刺原生質(zhì)體存活和分裂的影響

IOA可以與磷酸甘油醛脫氫酶上的-SH發(fā)生不可逆的結(jié)合，通過抑制酶的活性，阻止 3-磷酸甘油醛氧化生成 3-磷酸甘油酸，抑制糖酵解途徑，細(xì)胞由于得不到能量供應(yīng)而停止分裂或死亡。只有當(dāng)IOA處理的細(xì)胞與細(xì)胞質(zhì)完整地細(xì)胞融合，代謝上得到互補(bǔ)，才能正常生長[15]。試驗(yàn)用1.0、2.0、5.0、10.0 mmol/L四種濃度IOA處理ApA410 min，表1顯示，隨處理濃度的增加，原生質(zhì)體的存活率逐漸下降。培養(yǎng)3 d后，經(jīng)10 mmol/L IOA處理的原生質(zhì)體幾乎無原生質(zhì)體分裂，原生質(zhì)體活力已經(jīng)受到嚴(yán)重?fù)p傷。5.0 mmol/L IOA處理的原生質(zhì)體存活率僅有 14.4%。且原生質(zhì)體大多不能分裂，個(gè)別能分裂的原生質(zhì)體最多能分裂 2～3次，繼續(xù)培養(yǎng)不能形成細(xì)胞團(tuán)。1.0、2.0 mmol/L兩個(gè)不同濃度的IOA處理的原生質(zhì)體30 d后部分形成肉眼可見的大細(xì)胞團(tuán)。因此，以5.0 mmol/L的IOA處理10 min為原生質(zhì)體預(yù)處理的適宜條件。

表1 不同濃度IOA對ApA4原生質(zhì)體活力的影響Table 1 Effect of IOA on protoplast viability of ApA4

2.2 原生質(zhì)體濃度對原生質(zhì)體形成串珠的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)電融合細(xì)胞隊(duì)列時(shí)間與 2種原生質(zhì)體混合濃度呈負(fù)相關(guān)。在相同 AC的條件下，濃度越高，需要的隊(duì)列時(shí)間越短，否則，形成的細(xì)胞串較長，多元融合增加。在一定范圍內(nèi)，濃度偏低，細(xì)胞排隊(duì)時(shí)間須延長，且融合頻率下降。

由表2可以看出：濃度為1.0×106個(gè)/mL時(shí)，25 s原生質(zhì)體串長就超過 4個(gè)，而濃度為1.0×105個(gè)/mL時(shí)，45 s原生質(zhì)體串長只有少數(shù)形成2～4個(gè)；原生質(zhì)體混合濃度為3.0×105個(gè)/mL，時(shí)間為45 s時(shí)，細(xì)胞串長多為2～4個(gè)，有利于產(chǎn)生2個(gè)細(xì)胞的異源融合體。以后的試驗(yàn)均在該濃度下進(jìn)行。

2.3 電場因素對原生質(zhì)體融合的影響

2.3.1AC對原生質(zhì)體串珠形成的影響

不同 AC對原生質(zhì)體形成串珠的長短有很大影響。實(shí)驗(yàn)表明，在 AC作用下，鷹嘴紫云英和駱駝刺的原生質(zhì)體首先靠近并逐漸排隊(duì)成串珠 (圖1a)，隨著 AC的增大，原生質(zhì)體形成串珠的時(shí)間縮短，而串珠的長度增長。但當(dāng)電壓過高時(shí)，原生質(zhì)體往往嚴(yán)重變形，在施加直流脈沖后很容易發(fā)生破裂(表3)。125 V/cm時(shí)，原生質(zhì)體隊(duì)列時(shí)間最短，形成隊(duì)列細(xì)胞數(shù)目合適且無變形，為合適的電融合交流電壓。

表2 原生質(zhì)體混合濃度與細(xì)胞隊(duì)列時(shí)間的關(guān)系Table 2 Relation between the general density of protoplast and the alignment time

表3 不同交流脈沖對融合頻率的影響Table 3 Effect of different alternating current impulse on fusion frequency

2.3.2直流脈沖對原生質(zhì)體融合的影響

在保持AC為125 V/cm的條件下，不同的DC對鷹嘴紫云英和駱駝刺原生質(zhì)體的融合有很大影響。圖2a顯示當(dāng)DC在0.75～1.35 kV/cm時(shí)，原生質(zhì)體融合頻率隨著 DC的增大而上升，最大融合頻率為24.2%。在0.75 kV/cm以下時(shí)則很少發(fā)生融合，而高于 1.35 kV/cm時(shí)融合頻率開始下降。這說明1.35 kV/cm的DC比較適合鷹嘴紫云英和駱駝刺原生質(zhì)體的融合 (圖1b)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，2～5個(gè)原生質(zhì)體的短串珠往往容易產(chǎn)生1對1的融合體，而長串珠往往形成多核融合體。

圖1 原生質(zhì)體電融合及培養(yǎng)與再生Fig.1 Electrofusion and culture and regeneration of protoplasts. (a, b) Protoplast bunchs in electric field. (c) Two cells beginning to fuse in direct current. (d) Two cells fusing when 1 minute after direct current. (e) A bigger protoplast after fusion. (f) First division of fusion cell. (g) Calli from fusion cell in liquid thin layer cultures. (h) Calli from fusion cell on selective medium. (i) Plantlets from selected somatic hybrid calli.

圖2 直流脈沖 (a) 和直流脈沖幅寬 (b) 對電融合頻率的影響Fig.2 Effect of different impulse (a) and broad (b) of DC on electrofusion frequency.

2.3.3直流脈沖幅寬對原生質(zhì)體融合的影響

在最佳AC和DC條件下，比較不同的直流脈沖幅寬對原生質(zhì)體融合的影響時(shí)發(fā)現(xiàn) (圖2b)，隨著脈沖幅寬的增加，鷹嘴紫云英和駱駝刺原生質(zhì)體的融合頻率逐漸提高，在脈沖幅寬為40 μs時(shí)，原生質(zhì)體的融合頻率最高，為24.3%。這與Chaput等[16-18]用電融合儀在相似的條件下獲得的融合頻率非常相近。但當(dāng)脈沖幅寬超過50 μs時(shí)融合頻率則明顯下降。

2.3.4直流脈沖次數(shù)對原生質(zhì)體融合的影響

在使用交流脈沖為 125 V/cm，直流脈沖為1.5 kV/cm，脈沖幅寬為 40 μs時(shí)，進(jìn)行脈沖 1、2、3、4、5次處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn) (圖3)，直流脈沖2或3次的處理，鷹嘴紫云英和駱駝刺的原生質(zhì)體融合頻率較高。而脈沖次數(shù)在 4次以上的處理不僅不能促進(jìn)融合，而且還會(huì)使已經(jīng)形成的融合體破裂，從而使原生質(zhì)體的融合頻率明顯下降。故本實(shí)驗(yàn)采用 2次直流脈沖次數(shù)對原生質(zhì)體進(jìn)行融合。

2.4 甘露醇濃度對原生質(zhì)體融合的影響

在最適電融合參數(shù)處理的條件下，不同的甘露醇濃度對鷹嘴紫云英和駱駝刺原生質(zhì)體融合也有一定影響 (圖4)。在CaCl2濃度為0.25 mmol/L時(shí)，融合液的甘露醇濃度由0上升至0.7 mol/L時(shí)，原生質(zhì)體融合頻率明顯上升，但當(dāng)甘露醇濃度高于0.7 mol/L后，原生質(zhì)體的融合頻率開始下降，這說明較低的滲透壓可能有利于鷹嘴紫云英和駱駝刺的原生質(zhì)體融合。

圖3 脈沖次數(shù)對電融合頻率的影響Fig.3 Effect of pulse number on protoplast electrofusion frequency.

圖4 甘露醇濃度對電融合頻率的影響Fig.4 Effect of mannitol density on electrofusion frequency.

融合過程中觀察到：2個(gè)或 2個(gè)以上呈圓球形的原生質(zhì)體融合后體積變大，有 2個(gè)靠攏的細(xì)胞逐漸變?yōu)闄E圓形，最后成為含有 2個(gè)細(xì)胞核的圓形細(xì)胞。整個(gè)過程在1.5 min內(nèi)完成。融合后又恢復(fù)圓形的細(xì)胞要比未融合的原生質(zhì)體體積顯著增大 (圖1c，d，e)。

2.5 融合細(xì)胞的培養(yǎng)和雜種的篩選及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中觀察到，轉(zhuǎn)至固體篩選培養(yǎng)基后，同源融合細(xì)胞和淺黃色的雙親愈傷組織均不再持續(xù)生長，綠色的雜種細(xì)胞卻具有明顯的生長優(yōu)勢，1周時(shí)間就能生成0.5 cm左右的綠色愈傷組織，明顯區(qū)別于雙親。每塊綠色的雜種愈傷組織來自于 1個(gè)克隆，經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得 10塊愈傷組織 (圖 1h)，其中無性系S7、S9、S10已經(jīng)再生小植株 (圖1i)。

2.6 融合愈傷組織雜種性質(zhì)的鑒定

2.6.1愈傷組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和同工酶分析

ApA4原生質(zhì)體在成為肉眼可見的小愈傷組織時(shí)，為淡黃色胚狀體，結(jié)構(gòu)致密；Acmetr原生質(zhì)體再生小愈傷組織則為淡黃色，結(jié)構(gòu)疏松。融合細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上直接生成淺綠色再生小愈傷組織。生長速度略快于兩個(gè)親本，顯示雜種優(yōu)勢。

Acmetr(2n=48) 愈傷組織由于多次繼代，染色體丟失，大多數(shù)染色體數(shù)目保持在 32～44條之間。ApA4(2n=18) 愈傷組織，由于發(fā)狀根時(shí)染色體數(shù)目就有丟失[14]，大多數(shù)保持在12～16條。融合再生愈傷組織的染色體數(shù)目接近雙親染色體數(shù)目之和(圖 5)。

過氧化物酶酶譜分析表明：具有雜種形態(tài)學(xué)特征的10個(gè)克隆均具有雙親的部分或全部特征帶，其中6個(gè)克隆還有新帶型產(chǎn)生 (圖6)。

2.6.2RAPD分析

用雙親總DNA作為模板，對12對隨機(jī)引物進(jìn)行篩選。取帶型穩(wěn)定、重復(fù)性好的S73(AAGCCGCG TC)，用于體細(xì)胞雜種愈傷組織及其雙親再生愈傷組織的RAPD分析。結(jié)果如圖7所示，雜種愈傷組織基本上含有雙親所有特征帶。

圖5 雜種及其雙親染色體Fig.5 Chromosome of somatic hybrid callus and their parents.1:Astragalus cicerL with 34 chromosome; 2: a hybrids with 44 chromosome; 3:Alhagi pseudalhagiwith 16 chromosome.

圖6 雙親及其雜種過氧化物酶譜分析Fig.6 Analysis of profiles of peroxidases of hybrids and parent calli. A:Alhagi pseudalhagi; 1–10: hybrid clones; B:Astragalus cicerL. character strip ofAstragalus cicerL;character strip ofAlhagi pseudalhagi; new strip.

圖7 雙親及其雜種的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析Fig.7 Analysis of RAPD of hybrids and parent calli. M：λDNA/Hind Ⅲ+EcoR Ⅰ DNA marker; 1:Alhagi pseudalhagi;2–11: hybrid clones; 12:Astragalus cicerL.

3 討論

通常涉及到豆科牧草的體細(xì)胞雜交都是采用PEG融合法，盡管這一方法是有效的，但電融合可以獲得更高的融合頻率[19-20]。本研究利用適宜的電融合參數(shù)獲得的總?cè)诤项l率為 25%左右，這一結(jié)果與以前報(bào)道的電融合率在20%～35%之間是一致的[21]。電融合參數(shù)的優(yōu)化依賴于以下幾個(gè)因素：用以融合的親本原生質(zhì)體的大小與來源[22]；脈沖電場強(qiáng)度和脈沖次數(shù)，在許多研究中，脈沖電場強(qiáng)度的應(yīng)用范圍從0.5到2.1 kV/cm，脈沖次數(shù)為1～4次[23]，也與本研究結(jié)果一致。

高的異源融合頻率對于不易檢出的異核體尤為重要。本研究中 2個(gè)親本來源的原生質(zhì)體形態(tài)非常相似，用肉眼直接鑒定幾乎不可能。如果不能將雜種細(xì)胞挑選出來，就需要培養(yǎng)大量的非雜種愈傷組織和再生植株。在原生質(zhì)體融合的早期，已經(jīng)發(fā)展了一些篩選方法，包括熒光活性染色檢出法、抗生素抑制法、生理互補(bǔ)法等。Brewer等[24]發(fā)現(xiàn)Thlaspicaerulescens和Brassica napus的雜種細(xì)胞具有較強(qiáng)的貼壁生長的物理性質(zhì)，從而區(qū)別于雙親。本實(shí)驗(yàn)采用IOA預(yù)處理使ApA4細(xì)胞質(zhì)失活，不能進(jìn)行分裂，而另一親本不能在無激素培養(yǎng)基上生長，融合細(xì)胞利用生理互補(bǔ)的方法在無激素培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。

用未經(jīng)電融合的雙親混合培養(yǎng)作對照，發(fā)現(xiàn)電融合并不影響原生質(zhì)體的活力，F(xiàn)DA染色[25]結(jié)果表明融合的原生質(zhì)體超過80%是有活性的。融合細(xì)胞要經(jīng)過一段時(shí)間，大約4 d，才開始生出新壁，變?yōu)闄E圓形，進(jìn)入分裂期。一旦進(jìn)入一次分裂 (圖1f)，很快經(jīng)過多次連續(xù)分裂逐步形成多細(xì)胞團(tuán) (圖1g)。到第8天，在DPD培養(yǎng)基中約有10%的原生質(zhì)體分裂。

本研究首次在沙漠豆科植物與豆科牧草間采用電融合的方法進(jìn)行原生質(zhì)體融合，經(jīng)雜種細(xì)胞的篩選、培養(yǎng)獲得了鷹嘴紫云英和駱駝刺屬間體細(xì)胞雜種愈傷組織和再生小植株。對雜種再生愈傷組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)、染色體觀察、同工酶和RAPD分析，均顯示雜種含有雙親染色體。該實(shí)驗(yàn)體系的建立，將有利于探索開發(fā)利用沙漠植物遺傳資源，使沙漠植物抗旱性狀通過體細(xì)胞雜交轉(zhuǎn)移到其他植物中成為可能。

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Intergenus somatic hybridization betweenAlhagi pseudalhagiandAstragalus cicerby electroporation

Gaina Zhang1,2, Jingfen Jia2, Xiangsheng Kong1, and Huawei Xu1

1College of Agriculture,Henan University of Science and Technology,Luoyang471003,China
2Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology,School of Life Science,Northwest University,Xi’an710069,China

Received:October 27, 2009;Accepted:March 17, 2010

Corresponding author:Gaina Zhang. Tel: +86-379-64282340; E-mail: zgnluck1@163.com