山羊克隆胎兒不同組織中H19基因CpG島甲基化模式及表達量檢測

李長雷，鄭聰穎，劉軍，蘭杰，李文哲，張涌

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物生殖生理與胚胎工程重點實驗室，楊凌 712100

動物及獸醫(yī)生物技術(shù)

山羊克隆胎兒不同組織中H19基因CpG島甲基化模式及表達量檢測

李長雷，鄭聰穎，劉軍，蘭杰，李文哲，張涌

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物生殖生理與胚胎工程重點實驗室，楊凌 712100

表觀重編程異常是核移植胚胎發(fā)育異常的重要原因。為了研究克隆山羊胎兒不同組織中H19基因CpG島甲基化水平和相對表達量，本實驗運用亞硫酸鹽法和熒光實時定量PCR法分別檢測了死亡克隆山羊胎兒和同期普通山羊胎兒 (對照組) 肝臟、胎盤、腎臟、肺臟和心臟組織中H19基因CpG島甲基化水平和mRNA的相對表達量。結(jié)果表明，克隆山羊胎兒胎盤組織中H19基因第5個CpG島的甲基化水平顯著高于對照組 (70%vs49.41%，P＜0.05)，H19基因相對表達量顯著低于對照組 (883.3vs1 264.5，P＜0.05)；肺臟組織甲基化水平顯著低于對照組 (63.53%vs88.24%，P＜0.05)，相對表達量顯著高于對照組 (1 003.4vs515.5，P＜0.05)；其他各組差異不顯著 (P＞0.05)。結(jié)果說明，H19基因在克隆山羊胎兒部分組織中 DNA甲基化重編程異常，而且這種異常影響H19基因的正常表達，這也可能是導(dǎo)致克隆動物死亡的重要因素之一。

克隆，山羊，H19基因，CpG島，甲基化模式，mRNA表達

Abstract:The aberrant epigenetic reprogramme is an important cause for abnormal development of nuclear transfer embryos. The objective of this study was to investigate the CpG island methylation profiles and relative expression levels ofH19gene in different tissues of cloned goat fetus. We detected liver, placenta, kidney, lung and heart in the dead cloned goat fetus and the age-matched normal goat fetus (control) by using bisulfite sequencing and real time PCR. Results indicated that methylation levels of the fifth CpG island ofH19gene in dead cloned goat fetus was significant high compared with that in the control in placenta (70%vs49.41%,P< 0.05), and relative expression levels ofH19gene was significant low compared with that in the control (883.3vs1 264.5,P<0.05). Reversely, the methylation levels was significant low compared with that in the control in lung (63.53%vs88.24%,P< 0.05),and relative expression levels was significant high compared with that in the control (1 003.4vs515.5,P< 0.05). The differences of others groups were insignificant (P> 0.05). Results showed the abnormal DNA methylation proflies ofH19gene occurred in some tissues of cloned goat fetus, which affected normal expression levels ofH19gene, indicating that aberrant DNA methylationreprogramme may be one of the important factors for the death of cloned animals.

Keywords:clone, goat,H19gene, CpG island, methylation pattern, mRNA expression

自1996年Campbell等成功獲得第一例體細胞核移植綿羊以來，體細胞克隆技術(shù)已成功應(yīng)用于多種哺乳動物，但是通過核移植技術(shù)得到健康克隆動物的效率非常低，體細胞核移植動物的流產(chǎn)率和新生兒死亡率遠高于體外受精和人工受精得到的動物，即使是存活下來的克隆動物也常伴有表型異常和不同程度的發(fā)育缺陷，研究表明表觀重編程異常是核移植胚胎發(fā)育異常的重要原因之一[1-3]。DNA甲基化是基因組主要的表觀遺傳修飾方式之一，它對哺乳動物發(fā)育相關(guān)基因的正確表達有著重要的調(diào)控作用[4]。核移植過程中，供體核要關(guān)閉自身的基因表達模式，建立胚胎發(fā)育的基因表達模式，DNA甲基化異常可能導(dǎo)致基因表達紊亂，從而影響核移植胚胎的發(fā)育[5]。

目前估計哺乳動物含有20 000～25 000個基因[6]，它們中很大一部分與植入前胚胎和胎兒生長發(fā)育的調(diào)控有關(guān)，其中一部分要發(fā)生基因印記，即機體僅表達來自親本一方的等位基因，而另一方不表達或很少表達。到目前為止，在人和哺乳動物中已經(jīng)分離和鑒定出的印記基因有 70多個[7-9]。H19、IGF2(Insulin-like growth factor 2) 及其受體IGF2R是3個被研究較多的印記基因，它們參與調(diào)控植入前胚胎和胎兒的生長發(fā)育。H19編碼一個非翻譯性RNAs，是一種生長調(diào)節(jié)基因，它在胚胎組織中高度表達，出生后在很多組織中受到了明顯表達抑制[10]。它在細胞的增殖和分化方面具有雙重作用；可以調(diào)節(jié)胚胎的生長和發(fā)育、胚胎在子宮內(nèi)的生長以及新生兒的生長，印記功能的紊亂將導(dǎo)致多種發(fā)育異常及死胎[11]。截至目前，關(guān)于印記基因H19表達的研究已經(jīng)在克隆小鼠[12-13]、克隆綿羊[14]、克隆牛[15-16]等動物上進行。然而山羊上的相關(guān)報道很少，而且在克隆山羊胎兒不同組織中H19基因CpG島甲基化和表達情況尚不清楚。

在本實驗中，運用亞硫酸鹽法測定并比較了H19基因CpG島在死亡克隆山羊胎兒和同期成活普通山羊胎兒 (對照組) 肝臟、胎盤、腎臟、肺臟和心臟組織中的甲基化率，并運用實時熒光定量PCR法測定比較了H19基因在各組織中的相對表達量。實驗結(jié)果表明，在克隆山羊胎兒部分組織中H19基因表達存在異常，其原因可能是H19基因CpG島發(fā)生了異常甲基化，這些發(fā)現(xiàn)為提高核移植效率提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及設(shè)備

1.1.1材料來源

克隆山羊胎兒出生 3 h后死亡；同期成活普通山羊胎兒 (對照組，山羊品種均系西農(nóng)莎能奶山羊，下同)，來自于楊凌科元克隆有限責(zé)任公司，出生后人為處死，無菌條件下解剖分離肝臟、胎盤、肺臟、腎臟和心臟等組織，封閉保存在?70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑及儀器

TIANamp Genomic DNA Kit (離心柱型，DP304)，EZ DNA Methylation-Gold KitTM(D5006)、凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒小量制備純化試劑盒(TaKaRa，Japan)；pMD18-T 載體 (Promega，USA)；Power SYBR Green PCR Master Mix (ABI，USA)；SuperScriptTMⅢRT-PCR Kit (Invitrogen，USA)；DH5α感受態(tài)細胞 (Tiangen, Germany)；PCR (Bioer,China) 儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1DNA提取及甲基化處理

無菌條件下，按照 DNA提取試劑盒 (離心柱型，DP304) 要求分別提取死亡克隆山羊胎兒和同期普通山羊胎兒的肝臟、胎盤、肺臟、腎臟和心臟組織基因組DNA，按EZ DNA Methylation-Gold KitTM(D5006) 要求進行DNA甲基化處理。

1.2.2DNA擴增、克隆和測序

山羊H19基因公布的DNA序列長度為4 199 bp(Accession No. EF577239)，經(jīng) MethPrimer-DesignPrimers for Methylation PCRs軟件檢測有8個CpG島，按照CpG島排列順序，把位于2 861 bp～2 994 bp之間的稱之為第5個CpG島，與啟動子 (2 732 bp～2 982 bp) 有部分重疊，所以測定第5個CpG島甲基化情況有代表性。Primer5.0設(shè)計特異性引物：F:5′-TAGTTTTTTGGTGGTATAGGGTTTT-3′，R:5′-A CAAACTCCCACATTTAACCATAAT-3′ (F，forward；R，reverse)。PCR反應(yīng)體系50 μL，體系反應(yīng)條件如下：95 ℃ 10 min ；95℃30s，55℃40s，72℃40s，40個循環(huán)；72 ℃ 7 min 。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收 DNA；取 4 μL回收 DNA與pMD18-T載體，4℃連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含有Amp的LB平皿，37℃培養(yǎng)12 h。挑取菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后測序。

1.2.3甲基化序列分析

死亡克隆山羊胎兒和同期普通山羊胎兒的肝臟、胎盤、肺臟、腎臟和心臟組織分別取10個克隆結(jié)果進行分析，克隆序列用BIQ Analyzer軟件進行數(shù)據(jù)整理和在線分析 (http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/)。

1.2.4總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和實時定量 PCR

按照SuperScriptTMⅢ RT-PCR Kit (Invitrogen USA) 試劑盒的要求，分別提取死亡克隆山羊胎兒和同期普通山羊胎兒肝臟、胎盤、腎臟、肺臟和心臟組織總 RNA，總RNA提取后用凝膠電泳鑒定其質(zhì)量；取2 μg總RNA (最終濃度為80 ng/μL) 進行反轉(zhuǎn)錄。

山羊H19mRNA表達量的引物 F:5′-GGACTG GAACTTGGACTTCTTCA-3′；R:5′-TGGTGTGGGT CTTCCGTTC-3′[17]；山羊 GAPDH (CHI431207) 引物：F:5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′；R:5′-C CATCACAAACATGGGAGCG-3′[18]。在 12.5 μL 定量反應(yīng)體系中，1 μL模板cDNA，0.625 IUTaqDNA酶，2.5 μL 5×PCR buffer，0.3 mmol/L dNTPs，3.75 mmol/L MgCl2，正反引物各 0.5 μmol/L，0.625 μL 20 × SYBR green I；PCR 反應(yīng)條件：95℃1 min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，45個循環(huán)；最后 72℃5 min。循環(huán)結(jié)束后，完成溶解曲線圖，以檢驗PCR產(chǎn)物的純度。每組超純水作為陰性對照，每組PCR定量檢測重復(fù) 3遍。實時熒光定量分析用 2-ΔΔCt法。標本內(nèi)普通山羊和克隆山羊不同組織H19基因與內(nèi)標基因Ct值比較:ΔCt=C(t,m)?C(t,n)，標本間 ΔCt比較：ΔΔCt= ΔCt實驗組?ΔCt對照組，最后值以2-ΔΔCt計算。

1.2.5數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析

甲基化率差異顯著性檢驗采用卡方檢驗(Chisquare)，當(dāng)P＜0.05時統(tǒng)計學(xué)上差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 山羊胎兒不同組織中H19基因第5個CpG島目的片段擴增結(jié)果

山羊H19基因公布的DNA序列長度為4 199 bp(Accession No. EF577239)，擴增目的片段長度為230 bp，位于 2 770 bp～2 999 bp間，其中第5個CpG島位于2 861 bp～2 994 bp之間 (圖1)。

2.2 克隆山羊胎兒不同組織中H19基因第 5個CpG島甲基化狀況分析

H19基因第5個CpG島甲基化率在死亡克隆山羊胎兒肝臟、胎盤、腎臟、肺臟和心臟組織中分別為75.88%、70%、71.76%、63.53%、83.53%；在同期普通山羊胎兒肝臟、胎盤、腎臟、肺臟和心臟組織中分別為85.88%、49.41%、77.65%、88.24%、78.82% (圖2)。同類組織甲基化率差異性采用卡方檢驗，結(jié)果顯示在肝臟、腎臟和心臟組織中甲基化率差異不顯著 (P＞0.05)，然而克隆山羊胎兒胎盤組織甲基化率顯著高于對照組 (P＜0.05)，肺臟組織甲基化率顯著低于對照組 (P＜0.05)。結(jié)果表明，克隆山羊胎兒的肺臟和胎盤組織中H19基因第5個CpG島發(fā)生了異常的甲基化。

圖 1 死亡克隆山羊胎兒和同期普通山羊胎兒不同組織中H19基因目的片段Fig.1 Objective fragment ofH19in different tissues of dead cloned goat fetus and age-matched common goat fetus. 1?5:liver, placenta, kidney, lung and heart of age-matched common goat fetus; 6?10: liver, placenta, kidney, lung and heart of dead cloned goat fetus; M: DNA marker.

圖2 克隆山羊胎兒和同期普通山羊胎兒不同組織中H19基因的甲基化情況Fig.2 Methylation profiles ofH19gene in different tissues of cloned goat fetus and age-mathed common goat fetus. (A) Rate of methylation of CpG island in liver of dead cloned goat fetus: 75.88% (129/170). (B) Rate of methylation of CpG island in liver of age-matched common goat fetus: 85.88% (146/170). (C) Rate of methylation of CpG island in placenta of dead cloned goat fetus:70% (119/170). (D) Rate of methylation of CpG island in placenta of age-matched common goat fetus: 49.41% (84/170). (E) Rate of methylation of CpG island in kidney of dead cloned goat fetus: 71.76% (122/170). (F) Rate of methylation of CpG island in kidney of age-matched common goat fetus: 77.65% (132/170). (G) Rate of methylation of CpG island in lung of dead cloned goat fetus: 63.53%(108/170). (H) Rate of methylation of CpG island in lung of age-matched common goat fetus: 88.24% (150/170). (I) Rate of methylation of CpG island in heart of dead cloned goat fetus: 83.53% (142/170). (J) Rate of methylation of CpG island in heart of age-matched common goat fetus: 78.82% (134/170).

2.3H19基因在山羊胎兒不同組織中的相對表達量

為了驗證H19基因第5個CpG島甲基化異常是否會影響H19基因的表達，運用實時定量 PCR法，測定出H19mRNA在死亡克隆山羊胎兒和同期普通山羊胎兒肝臟、胎盤、腎臟、肺臟和心臟組織中的相對表達量，其比值依次為：1.36、0.70、1.16、1.95、0.87。結(jié)果顯示在肝臟、腎臟和心臟組織中H19mRNA 的相對表達量差異不顯著 (P＞0.05)，在胎盤組織中的相對表達量顯著低于對照組 (P＜0.05)，在肺臟組織中的相對表達量顯著高于對照組(P＜0.05) (圖 3)。

圖3 不同類型山羊胎兒不同組織中H19mRNA的相對表達量Fig.3 Relative expression ofH19mRNA in different tissues of different types goat fetus.

3 討論

體細胞核移植技術(shù)有力地證明了分化細胞再發(fā)育的潛能。核移植后供體細胞核的不完全修飾可能導(dǎo)致相關(guān)生長發(fā)育重要基因的異常表達，這導(dǎo)致了克隆動物出生率低下。印記基因的異常表達可導(dǎo)致表觀缺陷已在多種克隆動物上被驗證[19]。DNA甲基化可能與siRNA、microRNA[20-21]以及其他表觀遺傳修飾，共同來調(diào)節(jié)基因的時空表達[22]，因此檢測基因組CpG島甲基化模式是揭示基因正?；虍惓１磉_的重要事件。本試驗結(jié)果表明，克隆山羊肺臟和胎盤組織H19基因第5個CpG島甲基化異常，這種異常可以影響H19基因的正常表達。

本實驗運用亞硫酸鹽法處理基因片段，結(jié)果表明H19基因第5個CpG島甲基化水平在死亡克隆山羊胎兒胎盤和肺臟組織中相對于對照組差異明顯(P＜0.05)。運用實時定量 PCR法測定出H19基因在死亡克隆山羊胎兒和同期普通山羊胎兒不同組織(肝臟、胎盤、腎臟、肺臟和心臟) 中的相對表達量。結(jié)果表明H19基因相對表達量在死亡克隆山羊胎兒胎盤和肺臟組織中相對于對照組差異明顯 (P＜0.05)，而且H19基因甲基化結(jié)果和mRNA實時定量結(jié)果相吻合。H19基因第5個CpG島甲基化程度越高，H19基因mRNA的表達量低，甲基化程度越低，mRNA表達量高。克隆山羊胎兒胎盤和肺臟組織H19基因第5個CpG島甲基化異?？赡苁怯捎诠w核的錯誤重編程導(dǎo)致的，而且第5個CpG島與啟動子有部分重疊，對基因表達有調(diào)控作用，因此CpG島甲基化異常引起了基因表達的異常[23]。

H19基因呈母源性表達，與父源性基因IGF2形成交互印記作用[24]，對維持胚胎正常發(fā)育至關(guān)重要，它的表達異?？赡芤鹩∮浤Ｊ降腻e誤，導(dǎo)致胚胎發(fā)育異?；蛘甙l(fā)育終止。Lee等[25]在綿羊胚胎和由內(nèi)胚層及中胚層發(fā)育而來的胎兒肌肉和腎臟等組織中檢測到H19mRNA有較高表達量，但并沒有在由外胚層發(fā)育來的組織如滋養(yǎng)外胚層和胎兒腦部組織中檢測到它的表達。Young等[14]研究發(fā)現(xiàn)小鼠H19基因上游區(qū)域的 CpG島調(diào)控其自身的印記表達，Inoue等[26]和 Ogura等[27]檢測發(fā)現(xiàn)發(fā)育足月的克隆小鼠和對照組小鼠的胎盤，兩者的H19mRNA的表達量并無顯著差異，說明克隆小鼠發(fā)育到足月和出生后存活與印記基因的正常表達有著十分緊密的聯(lián)系。李寧等[28]研究發(fā)現(xiàn)H19基因在死亡克隆牛脾臟組織內(nèi)甲基化水平較高，在心臟組織內(nèi)水平較低而mRNA表達量較高；而在同期正常牛同類組織中H19基因甲基化水平相對穩(wěn)定。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)H19基因在出生后不久死亡的克隆牛胎兒不同組織中表達異常，呈雙等位基因表達。這些研究均說明H19基因能否正常表達對克隆胎兒的正常生長發(fā)育起著十分重要的作用。邢寶松等[17]通過成活體細胞克隆山羊和同期普通山羊耳部組織和舌部組織的檢測，發(fā)現(xiàn)在克隆山羊和非克隆山羊中H19mRNA的表達量沒有顯著性差異(P＞0.05)，但是沒有對其他組織中H19mRNA的表達量進行檢測。本實驗結(jié)果表明H19基因在克隆山羊死亡胎兒的肺臟和胎盤中異常表達。實驗過程中還發(fā)現(xiàn)克隆山羊死亡胎兒較正常山羊胎兒相比，個體偏小、體重偏輕、出生后3 h死于呼吸衰竭、胎盤肥大、肉脯減少、剖解未見器官異常。因此，H19基因的異常表達可能是導(dǎo)致克隆山羊死亡的重要原因之一。

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CpG island methylation patterns and expressions ofH19gene in cloned fetus of goat

Changlei Li, Congying Zheng, Jun Liu, Jie Lan, Wenzhe Li, and Yong Zhang

Key Laboratory of Animal Reproductive Physiology & Embryo Technology,College of Veterinary Medicine,Northwest Agriculture & Forestry University,Yangling712100,China

Received:November 21, 2009;Accepted:March 12, 2010

Supported by:Key Scientific and Technological Special Program for the Development of Transgenic Species of China (No. 2008ZX08007-004).

Corresponding author:Yong Zhang. Tel: +86-29-87080085; E-mail: zhy1956@263.net

國家“轉(zhuǎn)基因品種培育”重大科技專項資金 (No. 2008ZX08007-004) 資助。