鞣花酸對腫瘤細胞增殖抑制和誘導凋亡作用的初步研究

楊洪亮，張翼鷟，王曉芳，于 泳，趙智剛

（天津醫(yī)科大學 附屬腫瘤醫(yī)院，天津 300000；天津市腫瘤防治重點實驗室 血液腫瘤科）

鞣花酸對腫瘤細胞增殖抑制和誘導凋亡作用的初步研究

楊洪亮，張翼鷟，王曉芳，于 泳，趙智剛

（天津醫(yī)科大學 附屬腫瘤醫(yī)院，天津 300000；天津市腫瘤防治重點實驗室 血液腫瘤科）

目的：探討鞣花酸(ellagic acid)對腫瘤細胞的生長抑制作用及其機制.方法：用鞣花酸處理體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，用細胞增殖試驗（MTT法）、克隆形成試驗研究ELA對腫瘤細胞的增殖抑制作用，Brdu摻入試驗、流式細胞術檢測ELA對腫瘤細胞DNA合成、凋亡和細胞周期的影響.結果：用ELA處理后，腫瘤細胞增殖活性降低（p<0.05），克隆形成下降（p<0.005），Brdu標記指數降低（p<0.05），細胞周期分布改變，凋亡指數升高（p<0.01），G0/G1期細胞數增加（p<0.01），S期細胞數減少（p<0.01），在一定劑量內對正常細胞無明顯影響.結論：ELA對所試腫瘤細胞的增殖有顯著地抑制作用，其作用機理可能與抑制腫瘤細胞DNA合成，誘導腫瘤細胞凋亡和細胞周期阻滯有關.

鞣花酸；腫瘤細胞;增殖抑制；凋亡

鞣花酸是從各種堅果，軟果及水生植物中提取出來的一種天然多酚[1,6,7,8]，它具有天然抗氧化，清除體內自由基，保護低氧缺血所致心腦損傷等作用[2，3].目前研究表明，鞣花酸對前列腺癌有抑制作用[4-8].本研究觀察鞣花酸對E M T 6細胞、人肝癌細胞S M M C-7 7 2 1及正常肝細胞L-0 2的作用，通過體內和體外實驗觀察鞣花酸對腫瘤增殖的抑制作用.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 受試物

受試物為鞣花酸，鞣花酸購于清華大學生物科學技術系藥物藥理學研究室.R P M I-1 6 4 0購自G i b c o/B R L公司（I nv i t r o g e nC o r p o r a t i o n，U S A），胎牛血清為華西生物研究所產品（中國，成都），胰酶及D M S O均購自北京華美生物技術公司，噻唑藍（M T T）、5-溴脫氧尿苷（B r d u）為 S i g m a公司產品，A n t i-B r d u抗體為 Z y m e d公司產品，S-P試劑盒（S P 9 0 0 1）購自北京中杉金橋生物技術有限公司.

1.1.2 細胞及培養(yǎng)

小鼠乳腺癌細胞E M T 6、人肝癌細胞S M M C-7 7 2 1和正常肝細胞L-0 2購自中科院上海細胞生物研究所，用含1 0%胎牛血清、1 0 0 U/m l青霉素、1 0 0 μg/m l鏈霉素的 R P M I-1 6 4 0完全培養(yǎng)基，5%C O2，3 7℃培養(yǎng).

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞增殖試驗（M T T法）

用完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為1×1 04/m l，接種于9 6孔板，每孔2 0 0 μl，培養(yǎng)過夜使細胞貼壁，次日分別用不同劑量的 E L A(2.5、5.0、1 0、2 0、4 0 u g/m l)分別處理腫瘤細胞和正常細胞，對照組不處理，每個劑量組接種3個復孔，置3 7℃，5%C O2培養(yǎng)，分別于培養(yǎng) 1、2、3、4、5天后，取 1個培養(yǎng)板，每孔加入5 m g/m l M T T試劑1 0 u l，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，再加D MS O 1 0 0 u l，振蕩混勻1 5分鐘，用酶標儀（λ=5 7 0 n m）測定O D值（O D值與活細胞數成正比），取其平均值.E L A對處理細胞增殖活性的影響表示為：細胞存活率=處理組O D值÷實驗組O D值×1 0 0%，實驗重復3次.

1.2.2 克隆形成實驗

用完全培養(yǎng)液調整細胞濃度，接種于6孔板，每孔細胞數為3 0 0-4 0 0，每一劑量組接種3孔，培養(yǎng)過夜使細胞貼壁，次日分別用不同劑量的E L A(2.5、5.0、1 0 u g/m l)分別處理腫瘤細胞和正常細胞，對照組不處理，置3 7℃，5%C O2培養(yǎng)1 2天，甲醇固定，G i m s a染色，低倍鏡下觀察克隆形成，以大于5 0個細胞為標準，計數各孔克隆數，取其平均值，實驗重復3次.

1.2.3 B r d u摻入試驗

分別接種腫瘤細胞和正常細胞置有蓋玻片的六孔板內，5×1 05/孔，培養(yǎng)過夜，用5 u g/m l E L A處理細胞，對照組不處理.3 6 h后加入B r d u(2 0 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 1 2 h，固定(甲醇:丙酮=1:1)細胞貼片，2 M H C l處理3 0 m i n，硼酸緩沖液(p H=8.5)中和 5 m i n，P B S洗 3 m i n×3次，加 B r d u抗體(1:1 0 0)，置4℃過夜，P B S洗3 m i n×3次，加生物素化二抗，3 7℃孵育3 0 m i n，P B S洗 3 m i n×3次，加 s t r e p t a v i d i n/p e r o x i d a s e，3 7℃孵育3 0 m i n，P B S洗3 m i n×3次，D A B顯色，蘇木精復染.D A B顯色.顯微鏡下計數三個視野下的陽性和陰性細胞數.計算陽性細胞百分率即陽性細胞百分率＝陽性細胞數/（陽性細胞＋陰性細胞數）×1 0 0%.

1.2.4 細胞周期檢測(流式細胞術)

用5 u g/m l E L A分別處理腫瘤細胞和正常細胞，對照組不處理.4 8小時后收集各組細胞，用7 0%乙醇固定，加1%R N A酶3 7℃孵育3 0分鐘，用碘化丙啶（5 0 u g/m l）一步插入法D N A染色，上流式細胞儀檢測D N A含量、細胞周期分布及凋亡細胞.

1.2.5 統(tǒng)計學處理

所有實驗數據計算均數和標準差，細胞增殖實驗資料用方差分析處理，其他實驗數據用卡方檢驗處理，如果P﹤0.0 5，認為差異有顯著性.

2 結果

2.1 E L A抑制癌細胞增殖

E L A對小鼠乳腺癌細胞、肝癌細胞和正常肝細胞增殖均有抑制作用，具有劑量和時間效應關系（P<0.0 5）.對腫瘤細胞，I C50=5 u g/m l，正常細胞 I C50=1 0 u g/m l，當劑量為2.5 u g/m l時對正常細胞增殖無明顯影響(圖1).

2.2 E L A抑制癌細胞克隆形成

E L A對腫瘤細胞克隆形成有明顯的抑制作用，其抑制作用與E L A劑量成正相關(P<0.0 5)(圖2).

2.3 E L A抑制B r d u摻入

對照組小鼠乳腺癌細胞、肝癌細胞及正常肝細胞的B rd u標記指數分別為 6 6.2 5%±1.5%，5 9.2 3%±1.6%和6 6.6 7%±1.1%，用5 u g E L A處理3 6 h后，其標記指數分別為4 0.3 9%±1.3%，3 8.9 2%±1.1%和6 3.7 3%±1.3%.E L A處理使腫瘤細胞標記指數降低(p<0.0 5，圖3)，對正常細胞無影響(p>0.0 5).

2.4 E L A對細胞周期的影響

用5 u g/m l E L A處理腫瘤細胞4 8 h，凋亡指數和G0/G1期細胞數增加(p<0.0 1)，S期細胞數減少(p<0.0 1)，對正常細胞無作用(表1).

3 討論

本實驗主要探討了鞣花酸作為一種酚酸類物質對腫瘤細胞的抑制作用，目前許多實驗研究表明植物多酚具有明顯的防癌抗癌作用[10].鞣花酸屬于黃酮類多酚化合物，對多種腫瘤具有顯著的抑制作用.因此，鞣花酸防癌抗癌作用的研究已日益受到重視.

本實驗研究結果證實，E L A對小鼠乳腺癌細胞、人肝癌細胞增殖均有顯著的抑制作用（P<0.0 5），I C50=5 u g/m l時，并具有劑量、時間效應關系.實驗結果證明，E L A對腫瘤細胞增殖具有抑制作用.同時，E L A對正常肝細胞增殖也有一定程度的抑制作用（I C50=1 0 u g/m l）.當劑量為 2.5-5 u g/m l時，對正常細胞增殖、凋亡及細胞周期無明顯影響.結果提示，E L A的毒性作用不容忽視.

本實驗研究結果證實，腫瘤細胞用5 u g/m l E L A處理3 6 h后，B r d u標記細胞顯著低于未處理細胞(p<0.0 5，圖3)，對正常細胞無影響(p>0.0 5)，結果提示，E L A抑制了腫瘤細胞D N A合成，使B r d u摻入減少.G l→S轉換被認為是細胞周期最重要的調控點，因為它受到許多細胞周期相關蛋白的調控.G1期阻滯是細胞增殖抑制的重要環(huán)節(jié)，阻滯后細胞不能進入S期，D N A合成無法完成，干擾了蛋白質代謝，從而抑制腫瘤細胞的分裂.已有的研究表明，鞣花酸對細胞周期G1／S轉換點的調節(jié)具有重要作用.本實驗通過流式細胞儀檢測進一步證實E L A處理使腫瘤細胞凋亡指數和G0/G1期細胞數增加(p<0.0 1)，結果表明，E L A可誘導腫瘤細胞凋亡和G 0/G 1期阻滯.

綜上可見，E L A對小鼠乳腺癌細胞和肝癌細胞的增殖有顯著的抑制作用，其作用機理可能與抑制腫瘤細胞D N A合成，誘導腫瘤細胞凋亡和細胞周期阻滯有關.但其毒副作用亦不容忽視，值得進一步深入研究.

表1 E L A對對人腫瘤細胞和正常細胞細胞周期的影響

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〔2〕Narayanan BA,Geafroy O,Willingham MC,et a1.p53 ／p21(WAF1 ／CIP1)expression and its possible role in G1 arrest and apoptosis in ellagic acid treated cancer cells[J].Cancer Lett,1999,(2):215—221.

〔3〕Li TM,Chen GW,Su CC,Lin JG,et a1.Ellagic acid indueed p53／p21 expression,G1 arrest and apoptosis in human bladder cancer T24ce11s[j].Anticancex Res,2005,25(2A):971—979.

〔4〕Narayanan BA,Re GG.IGF 一Ⅱdown regulation associated cell cycle arrest in colon cancer cells exposed|to phenolic antioxidant ellagic acid[J].Anticancer Res,2001,21(1A):359—364.

〔5〕Lin SS,Hung CF,Tyan YS,et al.Ellagic[correction of ellagica]acid inhibits arylamine N—acetyltransferase activity and DNA adduct formation in human bladder tulnor cell lines(T24 and TSGH 8301)[J].Urol Res,2001(6):371—376.

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〔7〕ALITTA G,GRECA N D,MONACO D,et al.In vito algal growth inhibition by phytotoxins of Typha latifloia[J].J Chen ECOL,1990,16:2637-2646.

〔8〕COPAL B,GOEL U.Competition and allelopathy in aquatic plant communities[J].The Botanical Review,1993,59(3):155-210.

〔9〕Mukherjee A K,Basu S,Sarkar N,et al.Advances in cancer therapy with plant based natural products.Curr Med Chem,2001,8(12):1467~1486.

〔10〕王修杰，袁淑蘭，魏于全 植物多酚的防癌抗癌作用[J].天然產物研究與開發(fā)，2005；17(4):508-517.

R 7 3-3 6

A

1673-260X（2010）10-0049-03