肝樂(lè)顆粒對(duì)肝纖維化大鼠纖維化指標(biāo)的影響*

姜 輝 吳芙蓉 薛 雪 張家富

肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征，也是肝硬化發(fā)生的前奏和必經(jīng)的中間環(huán)節(jié)，研究表明肝纖維化完全有逆轉(zhuǎn)的可能[1，2]。肝樂(lè)顆粒為安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院用于治療急慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化活動(dòng)期、肝炎病毒攜帶者的經(jīng)驗(yàn)方，具有疏肝理脾、活血解毒、兼以扶正利膽退黃之功效，在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中顯示出很好的療效。本研究通過(guò)復(fù)制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，觀察肝樂(lè)顆粒對(duì)肝纖維化大鼠纖維化指標(biāo)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）藥物：肝樂(lè)顆粒（安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑）、秋水仙堿（西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司）。（2）試劑：CCl4（汕頭市西隴化工廠）；透明質(zhì)酸（HA）試劑盒、層粘蛋白（LN）試劑盒、PⅢNP試劑盒、四型膠原（CⅣ）試劑盒、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所）；Trizol試劑（Introgen life technologies公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（Fermentas公司）。（3）動(dòng)物：SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量 180 ～220g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2008-0004。（4）儀器：8453E紫外分光光度計(jì) （美國(guó)安捷倫公司）；電子顯微鏡XDS-1B（重慶光電儀器總公司）；Hemal 8R冷凍離心機(jī)、壓縮機(jī)制冷式基因擴(kuò)增儀、GSG2000核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法 （1）分組及造模：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分為正常組、模型組肝樂(lè)顆粒低 （1.5g/kg）、中 （3g/kg）、高 （6g/kg）劑量組和秋水仙堿組 （0.1×10-3g/kg）；每組各10只。除正常對(duì)照組外，其余各組分別于大鼠背部皮下注射50％CCl4（0.1mL/100g），正常組給予等量花生油，每周2次，連續(xù)12周。第7周，各給藥組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，每天1次，連續(xù)6周。末次給藥后，禁食8h處死動(dòng)物。（2）一般形態(tài)學(xué)觀察：大鼠行動(dòng)、毛色、飲食、體重等變化情況。（3）血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：常規(guī)分離血清，放免法測(cè)定 HA、LN、PⅢNP、CⅣ、TGF-β1的含量，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。（4）RT-PCR測(cè)定肝組織Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)：取100mg大鼠肝臟組織，采用Trizol法抽提RNA，總反應(yīng)體系20μL，42℃水浴1h，合成第一鏈cDNA。取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1uL作為反應(yīng)模板，反應(yīng)體系為25uL。Ⅰ型前膠原：5-TACAGCACG CTTGTGGATG-3（上 游 ）； 5-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3（下游）。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性 5min，94℃變性 40s，51℃ 退火40s，72℃延伸1min，32個(gè)循環(huán)，再72℃延伸10min，4℃保存。β - actin：5-TGGAATCCTGTGGCATCCATGA AAC-3（上游 ）；Forward：5-ACGCAGCTC AGTAACAGTCCG-3（下游）。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 4 0s，51℃ 退火 4 0s，72℃延伸1min，32 個(gè)循環(huán)，再 7 2℃延伸10 min，4℃保存。以 5 μL PCR 產(chǎn) 物在凝膠上電泳，攝像，存入計(jì)算機(jī)，并作圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般形態(tài)學(xué)改變情況 造模前，各組大鼠健康狀態(tài)良好，進(jìn)食、飲水正常，大便成形，毛色有光澤；造模3～5周后，除正常組外，其余各組大鼠均表現(xiàn)為易激惹，進(jìn)食量及飲水量明顯下降，大便不成形，毛色無(wú)光澤，體重下降，符合CCl4造模時(shí)的主要體征；給予受試藥物后，肝樂(lè)顆粒各劑量組進(jìn)食、活動(dòng)、毛色、體質(zhì)量較模型組有明顯改善。

2.2 各組大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ含量比較 見(jiàn)表1。與正常組比較，模型組大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，肝樂(lè)顆粒低、中、高劑量組肝纖維化大鼠升高的HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平顯著降低（P ＜0.05或 0.01）。

2.3 各組血清TGF-β1含量比較 見(jiàn)表1。與正常組比較，模型組大鼠血清TGF-β1水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，肝樂(lè)顆粒低、中、高劑量組肝纖維化大鼠TGF-β1水平顯著降低（P ＜ 0.05）。

表1 各組血清相關(guān)指標(biāo)比較（ng/mL，±s）

表1 各組血清相關(guān)指標(biāo)比較（ng/mL，±s）

與正常比較，*P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01

組 別正常組模型組肝樂(lè)顆粒低劑量組肝樂(lè)顆粒中劑量組肝樂(lè)顆粒高劑量組秋水仙堿組n 10 10 10 10 10 10 HA 126.23±26.37 219.26±29.09*180.72±45.36△169.56±34.01△△176.61±43.13△172.28±42.35△LN 67.38±15.50 102.46±17.08*80.77±16.32△84.44±20.88△72.19±18.82△△83.24±20.74△PⅢNP 56.69±7.81 84.39±19.75*76.30±13.98 66.96±11.53△△70.08±11.14△69.37±9.77△CIV 71.66±9.08 102.30±13.52*91.09±14.84△83.36±10.30△△88.91±14.88△84.36±10.48△△TGF-β1 8.09±3.13 23.89±6.77*18.60±4.41△19.36±5.19△18.47±4.89△18.67±3.45△

2.4 各組肝組織Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)圖1。RT-PCR結(jié)果分析顯示，模型組肝臟Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá)顯著高于正常組，而肝樂(lè)顆粒低、中、高劑量組Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá)下降。

圖1 各組大鼠肝組織中Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)的影響

3 討論

目前肝纖維化的血清標(biāo)志物主要有以下幾種。（1）HA：由間質(zhì)細(xì)胞合成，絕大多數(shù)存在于組織間隙或結(jié)締組織中，血清HA水平的增高與肝維化的程度呈正相關(guān)，可以較好地反映已生成的纖維化程度，是較敏感的反映肝纖維化損害程度的定量指標(biāo)[3]。（2）LN：為基底膜中特有的非膠原性結(jié)構(gòu)糖蛋白，血清LN值被認(rèn)為是反應(yīng)基底膜更新率的指標(biāo)，可反映竇毛細(xì)血管化和匯管區(qū)纖維化的范圍[4]。（3）PⅢNP：主要在活化的肝星狀細(xì)胞內(nèi)合成和釋放，肝纖維化時(shí)肝星狀細(xì)胞被激活大量合成PⅢNP。因此，PⅢNP能可靠地反映肝纖維化的活動(dòng)程度及肝病患者的肝臟組織學(xué)改變[5]。（4）CⅣ：為構(gòu)成基底膜的主要成分，反映基底膜膠原的更新率，CⅣ含量的增高可較靈敏反映出肝纖維化過(guò)程，是肝纖維化的早期標(biāo)志之一[6，7]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ均明顯高于正常組，表示造模成功；與模型組相比，肝樂(lè)顆粒各劑量組均能顯著降低肝纖維化大鼠升高的HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平，提示肝樂(lè)顆粒具有抗肝纖維化作用。

在肝纖維化發(fā)展過(guò)程中，活化的肝星狀細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)的主要產(chǎn)生細(xì)胞，多種細(xì)胞因子參與了肝星狀細(xì)胞的活化，其中TGF-β1是最有效的細(xì)胞因子。TGF-β1在肝纖維化過(guò)程中的主要作用是激活肝星狀細(xì)胞，促使細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增加，細(xì)胞外基質(zhì)不僅僅是量的明顯增加，同時(shí)還伴有質(zhì)的改變，如竇周的低密度基底膜膠原（Ⅳ、Ⅴ型為主）變?yōu)楦呙芏鹊拈g質(zhì)膠原（Ⅰ、Ⅲ型膠原為主）[8，9]。本研究顯示，肝樂(lè)顆粒能顯著降低肝纖維化大鼠血清TGF-β1水平，同時(shí)可抑制肝纖維化大鼠肝組織中Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá)，提示肝樂(lè)顆粒能有效降低細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗纖維化的作用。

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