光學(xué)比濁法血小板聚集試驗的標(biāo)準(zhǔn)化研究

李 濤,屈晨雪,王建中,袁家穎,張愛玉,龔 巖,汪 潤

(北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科,北京100034)

血小板聚集廣泛應(yīng)用于抗血小板藥物如阿司匹林[1],氯吡格雷[2]的治療監(jiān)測。光學(xué)比濁法血小板聚集試驗是檢測血小板聚集功能的金標(biāo)準(zhǔn)[3-5]。然而此法影響因素多,明顯影響了結(jié)果的重復(fù)性和可靠性。同時,血小板聚集試驗尚無通用的質(zhì)控品來對試驗全過程進(jìn)行質(zhì)量控制,這也是影響其重復(fù)性的原因之一。為此本研究擬從優(yōu)化光學(xué)比濁法血小板聚集功能試驗的影響因素入手,探討血小板聚集試驗的標(biāo)準(zhǔn)化,并通過制備質(zhì)控品和初步應(yīng)用,探討血小板聚集試驗室內(nèi)質(zhì)量控制中應(yīng)用質(zhì)控品的潛在可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康志愿者128例,其中男性70例,女性58例,年齡27-67歲(平均47.8歲)。健康志愿者均無心腦血管、血液或呼吸系統(tǒng)疾病,無高血壓病史,近期無感染及服用各種抗血小板藥物的病史。冠心病患者180例,為北京大學(xué)第一醫(yī)院2009年4月-2010年2月收治并經(jīng)冠脈造影術(shù)確診的患者,其中男性100例,女性80例,年齡43-73歲(平均56.6歲)。血小板聚集不良患者:血小板發(fā)生聚集后又明顯解聚的病例,共30例,男性16例,女性14例,年齡37-68歲(平均51.2歲)。健康志愿者及患者均采集空腹靜脈血,枸櫞酸鈉抗凝(109 mmol/L),3 h內(nèi)處理完成試驗。

1.2 主要試劑和儀器 二磷酸腺苷(ADP,美國Sigma公司);花生四烯酸(AA,美國Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO,美國Biomol公司);海藻糖(北京化學(xué)試劑公司);KX-21型血細(xì)胞分析儀(日本Sysmex公司);LBY-NJ4血小板聚集儀(北京普利生公司)。

1.3 方法

1.3.1 血小板聚集率測定 采集患者或健康志愿者空腹靜脈血,枸櫞酸鈉抗凝,離心制備富含血小板血漿(PRP),并計數(shù),以160g離心10 min制備乏血小板血漿(PPP)。按儀器要求以PPP管透光度為100%,以PRP管初始透光度為0%,加入誘導(dǎo)劑,記錄血小板聚集曲線及最大聚集率。

1.3.2 離心條件選擇 選擇不同離心力和離心時間制備PRP,共計9種離心條件,分別為:100 g離心5 min,100g離心10 min,100 g離心15 min,160 g離心5 min,160 g離心10 min,160 g離心15 min,200 g離心 5 min,200 g離心10 min和200g離心15 min。測定并計算不同離心條件所得PRP的血小板濃度、體積、血小板數(shù)量及最大PAR。

1.3.3 血小板濃度選擇 用PPP把對應(yīng)PRP中血小板濃度分別調(diào)為 100×109/L,150×109/L,200×109/L,250×109/L,300×109/L和350×109/L。以ADP(5μ mol/L)作為誘導(dǎo)劑,測定PAR。

1.3.4 誘導(dǎo)劑濃度選擇 PRP血小板濃度調(diào)至200×109/L,測定不同ADP濃度和不同AA濃度的PAR。ADP終濃度分別為 2.5、5、10、15和 20μ mol/L,AA 終濃度分別為 0.5、0.75、1.0、1.5 和2.0 g/L。

1.3.5 血小板聚集曲線分析 以ADP(5 μ mol/L)為誘導(dǎo)劑,測定并記錄3組樣本(對照組40例,冠心病組30例和血小板聚集不良組30例)的1 min、3 min、5min聚集率及最大聚集率和聚集曲線下面積。

1.3.6 不同F(xiàn)IB濃度與血小板最大聚集率的相關(guān)性 按聚集試驗反應(yīng)體積300μ l計算,采用不同比例的血清和PPP將PRP調(diào)至血小板濃度為200×109/L,配成不同濃度的FIB。以ADP(5 μ mol/L)為誘導(dǎo)劑,測定最大 PAR。

1.3.7 冠心病患者FIB含量和PAR之間的相關(guān)性 選健康人50例和冠心病患者150例,以ADP(5μ mol/L)為誘導(dǎo)劑,分別檢測其血漿FIB含量和血小板最大聚集率。

1.3.8 血小板聚集質(zhì)控品制備 取多名健康志愿者PRP,混勻后分為3份,①對照組:不加任何保護(hù)劑,每管1.5 ml分裝,至少10管。②DMSO組:用注射器向PRP中緩慢(＜1ml/min 注入DMSO使其終濃度達(dá)到5%,靜置10 min后每管1.5 ml分裝,至少10管。③DMSO+海藻糖組:PRP中加入DMSO(終濃度5%)和海藻糖(終濃度50 mmol/L),37℃水浴4小時后每管1.5 ml分裝,至少10管。三組在做好標(biāo)記后同時放入-70℃低溫冰箱中,定期取出,37℃復(fù)融后測定其PAR。

1.3.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,選擇單因素方差分析法比較各組間差異,兩組間比較采用LSD分析法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 離心條件的選擇 以分離出PRP體積＞500 μ l,血小板數(shù)量＞200×109/L且對PAR無影響為宜。最后選擇160 g、離心10 min為離心方法。

2.2 血小板濃度的選擇 隨著PRP中血小板濃度的增加,最大聚集率也增高。結(jié)果表明濃度過低(＜200×109/L)和過高(＞300×109/L)都會影響結(jié)果(P＜0.01),不能將血小板聚集功能缺陷和增強的患者區(qū)分開。最后選擇血小板聚集的終濃度為(200-250)×109/L較合適。

2.3 ADP濃度選擇 隨著ADP濃度增加,血小板最大聚集率增大。ADP濃度在5 μ mol/L(67.09±3.67)%,基本反映正常人血小板聚集功能,但又能檢測到ADP誘導(dǎo)的PAR減低或增高。

2.4 AA濃度選擇 隨著AA濃度的增大,PAR增高。選擇AA濃度為0.5g/L時(71.81±3.98)%,基本反映正常人血小板聚集功能,但又能檢測到AA誘導(dǎo)的PAR減低或增高。

2.5 血小板聚集曲線分析 冠心病組在1 min、3 min、5 min聚集率及最大聚集率和聚集曲線下面積明顯高于對照組(P＜0.05),也高于聚集不良組(P＜0.05),見表1;聚集不良組與對照組比較在1min,3min聚集率和最大聚集率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),但在5 min聚集率和曲線下面積間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 不同疾病組血小板聚集曲線參數(shù)比較(±s)

表1 不同疾病組血小板聚集曲線參數(shù)比較(±s)

注:*與對照組比較,P＜0.05;△與冠心病組比較,P＜0.05

分組 例數(shù)(n) 1 min聚集率(%) 3 min聚集率(%) 5 min聚集率(%) 最大聚集率(%) 聚集曲線下面積對照組 40 37.93±8.00 58.50±6.30 62.70±8.46 67.85±5.65 14 529.3±1 325.49冠心病組 30 52.66±6.94* 71.09±5.00* 75.00±6.19* 79.65±4.57* 18 088.39±1 336.05*聚集不良組 30 39.77±7.32△ 57.24±12.11△ 32.04±10.72*△ 62.65±5.50△ 9 851.64±1 574.65*△

2.6 FIB濃度與血小板最大PAR的相關(guān)性 隨著FIB濃度的增加,最大PAR也增大。冠心病患者體內(nèi)高FIB含量伴隨血小板聚集性增強,冠心病組和對照組之間最大PAR與FIB的比值(AFR)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),見表2.

表2 對照組與冠心病組間比較(±s)

表2 對照組與冠心病組間比較(±s)

注:*與對照比較,P＜0.01

分組 n FIB(g/L) 最大聚集率(%) 最大聚集率/FIB含量(AFR)對照組 50 3.21±0.50 64.90±4.62 20.57±2.50冠心病 150 4.44±0.32* 77.82±5.60* 17.57±0.91*

2.7 質(zhì)控品結(jié)果 未加保護(hù)劑的質(zhì)控品隨著保存時間的延長,聚集率明顯下降,基本失去了聚集性。DMSO組第1天至第6天聚集率基本穩(wěn)定,第10d聚集率開始下降,與前6天比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),表明DMSO組在10 d后聚集率下降明顯。DMSO加海藻糖組在15 d內(nèi)PAR差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),表明此組血小板聚集功能保存較好。

3 討論

血小板聚集是血小板參與生理止血的重要環(huán)節(jié)。同時,在許多病理性血栓形成過程中血小板聚集功能也發(fā)揮著先導(dǎo)而關(guān)鍵的作用。因此,檢測血小板聚集功能臨床出血與血栓性疾病的診斷及療效監(jiān)測有指導(dǎo)意義。光學(xué)比濁法血小板聚集試驗因其操作簡便、快速,易于掌握且經(jīng)濟(jì)和實用,故最常用,并作為”金標(biāo)準(zhǔn)”試驗[3-5]。然而此法影響因素多且在不同實驗室中實際操作方法不同,導(dǎo)致實驗結(jié)果重復(fù)性差,可比性不強,極大地限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。此外,試驗結(jié)果用最大PAR表示最為常用,但并不能完全反映血小板在誘導(dǎo)劑作用下聚集的反應(yīng)性和全過程,尤其是對于聚集后發(fā)生解聚的標(biāo)本更是如此。由于本試驗是測定采血后新鮮血漿中的血小板,因此該試驗一直沒有找到可以控制其精密度的室內(nèi)質(zhì)控物,使測定結(jié)果的準(zhǔn)確性沒有可靠的保證。為此本研究從優(yōu)化血小板聚集功能試驗的影響因素入手,探討血小板聚集試驗的標(biāo)準(zhǔn)化,從而為臨床提供更加準(zhǔn)確的資料。

光學(xué)比濁法的血小板聚集試驗需要首先進(jìn)行制備PRP,本研究根據(jù)文獻(xiàn)和臨床實際應(yīng)用觀察了9種不同離心條件對血小板聚集試驗的影響,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)這9中離心方法對PAR有顯著影響(P＞0.05),但對分離出的PRP體積,血小板濃度和血小板總數(shù)確有較大影響。本研究對是否需要調(diào)整血小板濃度也進(jìn)行了探討,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血小板濃度的確對最大聚集率有影響,濃度過低會使聚集率減小,我們推薦血小板濃度調(diào)整為(200-250)×109/L,較為適宜,使血小板聚集試驗測定結(jié)果穩(wěn)定,也有助于增加室間的可比性。

臨床上血小板聚集試驗結(jié)果普遍使用最大PAR表示,但即使最大PAR相同,聚集曲線也可能是顯著不一致,其臨床意義也不完全相同。本研究通過比較分析對照、冠心病和血小板聚集不良三組患者 1 min、3 min、5 min的PAR及最大PAR和聚集曲線下面積發(fā)現(xiàn),冠心病患者各個指標(biāo)均高于對照組;而血小板聚集不良組患者其最大PAR雖與對照組無差異,但5min聚集率和曲線下面積確顯著低于降低,這是因為血小板聚集后發(fā)生明顯解聚所致,提示血小板聚集性不穩(wěn)定。因此,采用最大聚集率和聚集曲線下面積兩種表達(dá)方式可能更準(zhǔn)確的反應(yīng)血小板聚集功能。

血小板聚集功能的發(fā)揮主要依靠其表面膜糖蛋白和血漿中的FIB。本研究通過調(diào)節(jié)血漿FIB濃度觀察PAR的變化,結(jié)果顯示二者呈現(xiàn)正相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)冠心病組最大PAR和血漿FIB濃度高于對照組,最大PAR與FIB含量的比值(AFR)顯著低于對照組,表明冠心病患者最大PAR增大與患者FIB濃度顯著增高相關(guān)[6]。在臨床觀察到冠心病等血栓性疾病患者最大PAR伴FIB濃度增高,且AFR降低時,提示FIB是導(dǎo)致其血小板聚集增高的主要因素;在抗血小板治療時,除服用血小板聚集抑制劑外,聯(lián)合服用降FIB含量的藥物可能會起到更好的抗栓效果。故建議在報告血小板最大聚集率的同時,報告AFR,可能更有助于選擇合適的藥物,提高療效。

血小板聚集試驗尚無國際或國內(nèi)通用的質(zhì)控品,其原因可能是因為在血小板保存過程中血小板數(shù)量、形態(tài)、生化和細(xì)胞功能均會發(fā)生變化,這種變化稱為”保存損傷”[7]。本研究發(fā)現(xiàn)加入DMSO和海藻糖兩種保護(hù)劑的質(zhì)控品,至少在15d內(nèi)其最大PAR能穩(wěn)定;但使用保護(hù)劑后,冰凍血小板的聚集性仍低于新鮮血小板,說明保護(hù)劑不能對血小板起到完全的保護(hù)作用。

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