堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)豬急性心肌梗死血管新生的意義

張洪宇,董明慧,張文琪,李樹(shù)巖

(1.大安市醫(yī)院內(nèi)科二療區(qū),吉林 大安131300;2.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院;3.吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院)

近年來(lái)血管生長(zhǎng)因子在急性心肌梗死治療領(lǐng)域的應(yīng)用受到人們的關(guān)注,在眾多生長(zhǎng)因子當(dāng)中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)因其具有促進(jìn)血管新生的生物學(xué)特性而備受矚目。bFGF基因位于人類(lèi)第5號(hào)染色體上,為單拷貝基因,由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。bFGF由146個(gè)氨基酸組成,分子量約為17.86 kD,對(duì)熱和酸敏感,易被蛋白酶降解,與肝素有特異性親和力[1]。bFGF在體內(nèi)分布極為廣泛,腦 、心 、肝 、腎 、腎上腺 、骨 、眼和胎盤(pán)等都有它的存在。在心血管系統(tǒng)中,血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均有合成bFGF的能力。而bFGF可以直接作用于成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)其分化、增殖、遷移形成向血管[2-4]。國(guó)內(nèi)外均有研究報(bào)道,對(duì)于急性心肌梗死,短期內(nèi)補(bǔ)充bFGF,有利于梗死區(qū)血管新生,進(jìn)而改善梗死區(qū)域的血流灌注,挽救瀕死或頓抑的心肌。本實(shí)驗(yàn)研究旨在探討經(jīng)導(dǎo)管向心肌梗死區(qū)域灌注bFGF基因重組腺病毒對(duì)心肌梗死區(qū)血管新生的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

8-12個(gè)月齡的小型豬12只,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地提供。bFGF重組腺病毒表達(dá)載體。Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體系列、SP試劑盒、DAB顯色劑(北京新華宇生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 球囊堵閉法建立小型豬急性心肌梗死動(dòng)物模型 12只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)前三日給予阿司匹林100 mg/日,術(shù)前禁食 12 h,禁飲4 h,沐浴后稱(chēng)重,安定10 mg、氯胺酮10 mg/kg肌注,于小型豬耳靜脈用靜脈套管針建立靜脈通路,以0.9%鹽水維持靜脈通路,同時(shí)給予速眠新0.25 ml/kg肌注,阿托品1 mg肌注。將小型豬移至導(dǎo)管床上,取仰臥位,胸部、腹股溝區(qū)及四肢用8%硫化鈉去毛后,用針電極連接胸部及四肢導(dǎo)聯(lián),記錄心電圖。常規(guī)消毒鋪巾,分離右側(cè)股動(dòng)脈,結(jié)扎遠(yuǎn)心端。經(jīng)右側(cè)股動(dòng)脈置入6F動(dòng)脈鞘管并給肝素5000 U,以后每隔1 h追加肝素1000 U。經(jīng)股動(dòng)脈徑路以左、右冠狀動(dòng)脈造影導(dǎo)管分別行左/右冠狀動(dòng)脈造影,觀察豬冠狀動(dòng)脈的分布情況。然后選用左冠指引導(dǎo)管到達(dá)左冠狀動(dòng)脈開(kāi)口后,送入冠脈導(dǎo)絲至前降支遠(yuǎn)端,根據(jù)造影結(jié)果選擇球囊(血管/球囊比率為1∶1.05)在導(dǎo)絲指引下置入2.0 mm×15mm或2.5 mm×15 mm球囊至第一對(duì)角支以遠(yuǎn)1 cm處,以3-4atm充盈球囊20 s/次,反復(fù) 3-4次,間隔3-5 min進(jìn)行預(yù)適應(yīng)。然后以8-10atm打開(kāi)球囊堵閉左前降支(LAD)中遠(yuǎn)段,造影顯示球囊遠(yuǎn)端前降支血流中斷,15 min后撤除球囊及鞘管,結(jié)扎血管,逐層縫合包扎。術(shù)中予連續(xù)心電監(jiān)護(hù),并于術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后 6、12、24小時(shí)抽靜脈血測(cè) CKMb。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩組。組Ⅰ:bFGF基因治療組(n=6)。用微球囊導(dǎo)管送至梗死相關(guān)冠脈,擴(kuò)張球囊并注射含有bFGF重組腺病毒表達(dá)載體的PS緩沖液5 ml;組Ⅱ:心肌梗死對(duì)照組(n=4)。通過(guò)微球囊導(dǎo)管送至梗死相關(guān)冠脈并灌注無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液5 ml。術(shù)后4周通過(guò)觀察冠狀動(dòng)脈造影及免疫組化法標(biāo)測(cè)Ⅷ因子內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)記,觀察心肌梗死區(qū)新生血管數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用方差分析證明各組方差齊性后采用LSD-t檢驗(yàn),以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

12只豬均成功完成冠狀動(dòng)脈造影,球囊成功導(dǎo)入前降支遠(yuǎn)端,制模2周后共有10只小型豬成活。2頭失敗模型中,1頭于冠狀動(dòng)脈LAD內(nèi)微球囊加壓過(guò)程中誘發(fā)室顫死亡,另外1頭制模后急性左心衰發(fā)作猝死,術(shù)中、術(shù)后不同時(shí)間描記心電圖及CKMB變化均證實(shí)豬心肌梗死模型成功。

2.2 bFGF基因治療后冠狀動(dòng)脈造影檢查結(jié)果

兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在成模2周后基因治療前行冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)前降支遠(yuǎn)端完全閉塞,同時(shí)通過(guò)采用Rentrop計(jì)分法[5](側(cè)支循環(huán)指數(shù)),判斷各組治療后缺血區(qū)灌注及心功能改善情況。基因治療前2組Rentrop評(píng)分無(wú)明顯差異。基因治療4周后冠狀動(dòng)脈造影檢查可見(jiàn):組Ⅰ實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的LAD及其分支充盈均有明顯改善,局部可見(jiàn)不同程度的側(cè)支充盈:組Ⅱ動(dòng)物未見(jiàn)顯著側(cè)枝血管形成。治療后Rentrop分?jǐn)?shù)組Ⅰ較組Ⅱ有顯著性提高(P＜0.01)。

表1 治療后 Rentrop評(píng)分情況(±s)

表1 治療后 Rentrop評(píng)分情況(±s)

治療后Rentrop分?jǐn)?shù),組Ⅰ與組Ⅱ比較,P＜0.01

組別 例數(shù) 治療后Rertop評(píng)分Ⅰ2.32±0.56Ⅱ4 1.00±0.27 6

2.3 免疫組化法鑒定梗死區(qū)新生血管情況

基因治療4周后,處死動(dòng)物取心臟標(biāo)本可見(jiàn)左心室前壁近心尖部分色澤蒼白,顯示心肌有缺血和梗死。取梗死區(qū)心肌標(biāo)本切片行免疫組化法標(biāo)測(cè)Ⅷ因子內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)記,結(jié)果顯示:組Ⅰ心肌梗死區(qū)內(nèi)部有明顯血管新生(22.4±2.3個(gè)MPF),血管多分布于移植細(xì)胞和殘存心肌細(xì)胞之間,邊緣區(qū)多于梗死區(qū),排列整齊,呈芽枝狀伸向梗死中心。毛細(xì)血管管壁較薄,無(wú)平滑肌,由一層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成(見(jiàn)圖1)。組Ⅱ無(wú)明顯血管新生(3.9±1.2個(gè)MPF)(見(jiàn)圖2)。正常心肌內(nèi)無(wú)血管新生。

圖1 hbFGH組VⅢ因子染色陽(yáng)性的移植區(qū)域×400

表2 基因治療4周后新生血管密度(±s)

表2 基因治療4周后新生血管密度(±s)

注:實(shí)驗(yàn)組間比較 P＜0.01

組別 例數(shù) 新生血管密度(個(gè)/HPF)Ⅰ22.4±2.3Ⅱ4 3.9±1.2 6

圖2 MI對(duì)照組染色呈陰性×400

3 討論

自1993年Hoekel提出了治療性血管生成[6]的概念后,利用生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)缺血組織的血管新生越來(lái)越受到人們的重視,同時(shí)也為急性心肌梗死的治療揭示了新的篇章。較多的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí):bFGF治療缺血性心臟病是可行、有效和安全的。Unger等在左冠狀動(dòng)脈回旋支狹窄模型中發(fā)現(xiàn),在狹窄動(dòng)脈支配區(qū)心肌內(nèi)注射bFGF,側(cè)支循環(huán)血流量和內(nèi)皮細(xì)胞DNA合成增加。并且認(rèn)為bFGF改善心肌缺血的作用得益于側(cè)枝循環(huán)的形成[7]。Schumache等1998年首次報(bào)道了bFCF的臨床應(yīng)用:入選40例多只病變并接受冠脈搭橋的患者,治療組20例于IMA/LAD吻合口遠(yuǎn)端靠近LAD處心肌局部注射bFGF,平均用量0.01 mg/kg;對(duì)照組20例于相同條件下注射熱滅活bFGF。12周后行冠狀動(dòng)脈造影及搭橋血管數(shù)字減影血管造影。結(jié)果顯示治療組其注射部位及以遠(yuǎn)端LAD供血區(qū)有明顯新生血管,所有受試者注射bFGF的心肌部位均出現(xiàn)毛細(xì)血管網(wǎng),從LAD近端伸出,延伸到周?chē)募?使周?chē)难┰黾恿私?倍,所有患者冠狀動(dòng)脈造影都沒(méi)有肉眼可辨的新狹窄形成[8]。在國(guó)內(nèi)蒙艷斌等將bFGF聯(lián)合胚胎干細(xì)胞D3株(ES-D3)局部注射于大鼠心肌梗死區(qū)域,移植后4周,bFGF+ES-D3移植組大鼠心肌梗死瘢痕區(qū)毛細(xì)血管密度顯著高于單用ES-D3移植組。表明ES-D3移植同時(shí)聯(lián)用bFGF使大鼠心肌梗死后血管新生增加[9]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)球囊堵閉法成功建立了小型豬急性心肌梗死模型,證實(shí)了該方法建立的動(dòng)物模型成功率高,動(dòng)物創(chuàng)傷小,存活時(shí)間長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)導(dǎo)管將bFGF基因重組腺病毒表達(dá)載體注入梗死區(qū)域,探討了bFGF基因治療對(duì)豬急性心肌梗死血管新生的作用。在基因治療4周后我們對(duì)兩組動(dòng)物行冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果進(jìn)行了比較:組I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的LAD及其分支充盈均有明顯改善,局部可見(jiàn)不同程度的側(cè)支充盈:組Ⅱ未見(jiàn)顯著側(cè)枝血管形成。Rentrop分?jǐn)?shù)組Ⅰ較組Ⅱ有顯著性提高(P＜0.01)。同時(shí)我們對(duì)梗死區(qū)心肌標(biāo)本進(jìn)行了Ⅷ因子相關(guān)抗原的免疫組化檢測(cè)。Ⅷ因子相關(guān)抗原位于內(nèi)皮細(xì)胞的weibel-palada小體上,抗Ⅷ因子的抗體是最特異的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物,能較好的顯示組織中的小動(dòng)脈、小靜脈和毛細(xì)血管,因此Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體復(fù)合物的免疫組化染色常作為反應(yīng)血管生成的間接手段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:組Ⅰ心肌梗死區(qū)內(nèi)部有明顯血管新生(22.4±2.3個(gè)MPF),而組Ⅱ無(wú)明顯血管新生?？梢宰C明bFGF有促新生血管作用。目前認(rèn)為bFGF促進(jìn)血管新生的機(jī)制如下:(1)bFGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、形成官腔。(2)bFGF能夠引起NO合酶表達(dá)上使內(nèi)皮細(xì)胞NO的釋放增多,導(dǎo)致內(nèi)皮依賴(lài)性舒血管反應(yīng),使?jié)撛诘膫?cè)支循環(huán)開(kāi)放[10]。(3)bFGF的血管生成作用有一部分是通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)及生成來(lái)實(shí)現(xiàn)[11]。

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