采油菌株Bacillus FH-1-2的培養(yǎng)特性研究

王 建 偉， 孫 玉 梅， 曹 芳， 王 培 忠

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

石油是一種不可再生能源，通過(guò)一次、二次采油后仍然有約60%的石油殘留在井下。微生物采油技術(shù)(MEOR)是利用微生物的有益活動(dòng)及代謝產(chǎn)物來(lái)提高原油采收率的一種綜合性采油技術(shù)，與傳統(tǒng)的三次采油技術(shù)相比，具有適用范圍廣、工藝簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)效益好的優(yōu)勢(shì)，具有良好的發(fā)展前景[1-2]。

采油微生物的培養(yǎng)特性與其采油應(yīng)用效果具有緊密的聯(lián)系。采用14C標(biāo)記的正十六烷作為銅綠假單胞菌PG201、UO299生長(zhǎng)基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)菌株所產(chǎn)鼠李糖脂有助于提高正十六烷在培養(yǎng)基中的溶解性，并且能夠提高細(xì)胞表面疏水性，細(xì)胞和烷烴的液滴直接接觸和假溶作用將烷烴轉(zhuǎn)運(yùn)到微生物細(xì)胞中[3]。通過(guò)Pseudomonasfluorescens利用砂巖管進(jìn)行穿越多孔介質(zhì)的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)處于饑餓狀態(tài)的菌體細(xì)胞比營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)良好的菌體細(xì)胞的流動(dòng)能力、穿越能力更強(qiáng)，并且表現(xiàn)出規(guī)律性更強(qiáng)的吸附性能[4]。

本文以發(fā)酵液的表面張力、pH值和菌體密度以及細(xì)胞疏水性為衡量指標(biāo)，研究采油微生物BacillusFH-1-2菌株的培養(yǎng)特性，為采油微生物的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌 種

BacillusFH-1-2由遼河油田豐華應(yīng)用技術(shù)綜合廠提供。

1.2 試 劑

試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純和化學(xué)純?cè)噭?/p>

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5，牛肉膏5，蛋白胨10，瓊脂20，pH 7.0。

LB種子培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5，牛肉膏5，蛋白胨10，pH 7.0。

發(fā)酵液培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO43.4，Na2HPO41.5，NaNO34，MgSO4·7H2O 0.7，酵母粉0.2，液蠟25 mL/L，pH 7.0[5]。

以上培養(yǎng)基均在1.03×105Pa蒸汽滅菌20 min。

1.4 菌體培養(yǎng)

1.4.1 菌種保存及活化

BacillusFH-1-2菌株在4 ℃保存于斜面培養(yǎng)基。取4 ℃保存的菌種，接種于斜面培養(yǎng)基，于30 ℃活化培養(yǎng)36 h。

1.4.2 種子液制備

取斜面活化的菌種培養(yǎng)物2環(huán)菌體接入100 mL種子培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶)，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.4.3 發(fā)酵液制備

于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶) 接種5%種子培養(yǎng)液。用棉塞封口，于30 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)好氧發(fā)酵。用聚乙烯保鮮膜封口，于30 ℃靜置培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)兼性厭氧發(fā)酵。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 菌體密度測(cè)定

采用比濁法于600 nm測(cè)定菌體密度[6]。移除發(fā)酵液上層油相，除油后的發(fā)酵液漩渦振蕩，取3 mL發(fā)酵液加入TritonX-100 (0.2%)溶液0.5 mL漩渦振蕩1 min，于3 000g離心15 min，倒掉上清液，用去離子水洗滌菌體2次，再用3 mL去離子水重懸菌體，去離子水為空白測(cè)定OD600。

1.5.2 細(xì)胞疏水性測(cè)定

采用BATH法于600 nm測(cè)定細(xì)胞疏水性[7]。移除發(fā)酵液上層油相，除油后的發(fā)酵液漩渦振蕩1 min，取3 mL發(fā)酵液，去離子水做空白，測(cè)定OD600值，然后加入0.1 mL石油醚，振蕩1 min，靜置30 s，再振蕩1 min，于30 ℃水浴靜置15 min，注射器取下層菌液測(cè)定BATH OD600。用BATH OD600/OD600表示細(xì)胞疏水性。

1.5.3 表面張力測(cè)定

采用表面張力儀(承德大華試驗(yàn)機(jī)有限公司)測(cè)定發(fā)酵液上清液表面張力。將發(fā)酵液用中速定性濾紙過(guò)濾除油，濾液于3 000g離心15 min除菌，上清液待測(cè)。

1.5.4 pH測(cè)定

采用PH3-3C精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)測(cè)定。

本研究所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均通過(guò)3次平行實(shí)驗(yàn)獲得。

2 結(jié)果與討論

2.1 好氧條件下的菌體培養(yǎng)特性

在好氧條件下培養(yǎng)BacillusFH-1-2，培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞疏水性、菌體密度以及培養(yǎng)液的表面張力和pH值的變化如圖1所示。

圖1 好氧條件下Bacillus FH-1-2的培養(yǎng)過(guò)程曲線Fig.1 Course curve for cultivating Bacillus FH-1-2 under aerobic condition

由圖1可見(jiàn)，在好氧培養(yǎng)BacillusFH-1-2的前24 h，菌體密度急劇上升，在培養(yǎng)的24～36 h，菌體密度上升速度減緩。培養(yǎng)36 h后，細(xì)胞進(jìn)入了生長(zhǎng)穩(wěn)定期。在培養(yǎng)84～108 h時(shí)的菌體達(dá)到最大生長(zhǎng)，108 h后進(jìn)入衰亡期。值得注意的是，在84～120 h菌體生長(zhǎng)與發(fā)酵液表面張力呈正相關(guān)，反之亦然。

在培養(yǎng)96 h前，培養(yǎng)液pH值緩慢上升，然后下降。發(fā)酵液pH降低是菌體將液體石蠟氧化成脂肪酸的結(jié)果[8]。

細(xì)胞疏水性是菌體接觸和吸收利用烴基質(zhì)的前提和保證[9]。表面活性劑通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的疏水性影響微生物細(xì)胞與烴類(lèi)之間的親和力。BacillusFH-1-2在培養(yǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出一定的細(xì)胞疏水性，為菌體生長(zhǎng)提供了保障，菌體生長(zhǎng)較穩(wěn)定。

在培養(yǎng)的前12 h培養(yǎng)液表面張力快速較大幅度下降，說(shuō)明BacillusFH-1-2很快利用烷烴代謝產(chǎn)生表面活性物質(zhì)。在培養(yǎng)12 h后，培養(yǎng)液表面張力有所上升，隨后變化幅度較小。表面活性物質(zhì)濃度變化會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液的表面張力發(fā)生變化，兩者具有良好的線性關(guān)系[10]。在培養(yǎng)108 h后菌體進(jìn)入衰亡期，此時(shí)發(fā)酵液表面張力明顯下降。表面活性物質(zhì)多為胞外產(chǎn)物或附著于細(xì)胞外[11]，當(dāng)細(xì)胞自溶時(shí)，附著于細(xì)胞外的表面活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到發(fā)酵液中，使培養(yǎng)液表面張力產(chǎn)生較大幅度的下降[12]。

2.2 兼性厭氧條件下的菌體培養(yǎng)特性

在兼性厭氧條件下培養(yǎng)BacillusFH-1-2，培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞疏水性、菌體密度以及培養(yǎng)液的表面張力和pH值的變化如圖2所示。

圖2 兼性厭氧條件下Bacillus FH-1-2的培養(yǎng)過(guò)程曲線Fig.2 Course curve for cultivating Bacillus FH-1-2 under facultative anaerobic condition

由圖2可知，在兼性厭氧培養(yǎng)BacillusFH-1-2的前48 h，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與好氧培養(yǎng)相似，培養(yǎng)48 h后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，與好氧發(fā)酵不同的是在培養(yǎng)96 h后細(xì)胞進(jìn)入二次生長(zhǎng)期。培養(yǎng)過(guò)程中的發(fā)酵液pH變化與好氧發(fā)酵相似，說(shuō)明溶氧量對(duì)發(fā)酵液pH變化沒(méi)有顯著影響。好氧和兼性厭氧條件下培養(yǎng)的細(xì)胞疏水性變化趨勢(shì)相近，但兼性厭氧培養(yǎng)生長(zhǎng)較慢，在培養(yǎng)120 h時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)接近最大且細(xì)胞疏水性略有升高，這說(shuō)明細(xì)胞疏水性對(duì)菌體生長(zhǎng)具有促進(jìn)的作用。

在兼性培養(yǎng)BacillusFH-1-2的過(guò)程中，表面張力和菌體生長(zhǎng)聯(lián)系緊密。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表面張力隨著細(xì)胞密度的增大而下降。在穩(wěn)定生長(zhǎng)期發(fā)酵液的表面張力出現(xiàn)振蕩狀態(tài)，表面張力隨著菌體密度的增大而升高，細(xì)胞利用表面活性物質(zhì)或生物表面活性物質(zhì)的前體進(jìn)行二次生長(zhǎng)，而后表面張力隨菌體密度下降而迅速下降。

2.3 好氧和兼性厭氧培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)特性比較

由圖3可見(jiàn)，在好氧和兼性厭氧培養(yǎng)條件下，菌體生長(zhǎng)趨勢(shì)相似，好氧培養(yǎng)菌體生長(zhǎng)更加旺盛，其衰亡也較快，而兼性厭氧培養(yǎng)的菌體生長(zhǎng)平穩(wěn)，穩(wěn)定期長(zhǎng)。兩種培養(yǎng)條件下的發(fā)酵液表面張力變化趨勢(shì)相近，但是兼性厭氧條件下發(fā)酵液的表面張力下降更多，更有利于原油采收。

圖3 好氧和兼性厭氧條件下菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵液表面張力Fig.3 Course curve for cell growth and surface tension of fermenting broth under aerobic and facultative anaerobic condition

由圖4可知，在好氧和兼性厭氧條件下，發(fā)酵液的pH變化趨勢(shì)基本一致，由此推測(cè)在培養(yǎng)過(guò)程中，溶氧量對(duì)pH變化影響不顯著，兼性厭氧條件下的菌體生長(zhǎng)較慢致使pH變化較慢。在發(fā)酵前期好氧比兼性厭氧條件下的細(xì)胞疏水性低，而后期卻升高很快。兩種條件下的細(xì)胞疏水性的變化趨勢(shì)相似，兼性厭氧比好氧條件下的細(xì)胞疏水性的變化滯后約60 h，其原因在于高溶氧量有利于菌體的生長(zhǎng)代謝。

在搖床上進(jìn)行的好氧發(fā)酵比在靜置狀態(tài)下進(jìn)行的兼性厭氧發(fā)酵的分子運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞的傳質(zhì)效果要好，以及二者溶解氧的差別，使好氧發(fā)酵和兼性厭氧發(fā)酵產(chǎn)生如上諸多差別。

圖4 好氧和兼性厭氧條件下的細(xì)胞疏水性和發(fā)酵液pHFig.4 Course curve for hydrophobic property of cell and pH of fermenting broth under aerobic and facultative anaerobic condition

3 討 論

采油菌株BacillusFH-1-2在好氧和兼性厭氧培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液的菌體密度、表面張力和pH值以及細(xì)胞疏水性均表現(xiàn)出變化且各參數(shù)相互影響。好氧和兼性厭氧發(fā)酵的參數(shù)變化趨勢(shì)非常相近，兼性厭氧發(fā)酵的參數(shù)變化較慢。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞疏水性和發(fā)酵液pH值均無(wú)顯著變化，發(fā)酵液接近中性，有利于菌體生長(zhǎng)，細(xì)胞疏水性保證了細(xì)胞與烴類(lèi)基質(zhì)的接觸和攝入。在不同生長(zhǎng)時(shí)期，菌體密度和發(fā)酵液表面張力具有不同的關(guān)系，即在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期發(fā)酵液表面張力隨菌體密度增加而降低，穩(wěn)定期和衰亡期發(fā)酵液表面張力和菌體密度正相關(guān)。兼性厭氧培養(yǎng)更有利于菌株BacillusFH-1-2應(yīng)用于原油采收。

[1] 張雪梅,佘躍惠,黃金鳳,等. 大慶油田聚合物驅(qū)后油藏微生物多樣性研究[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2008, 14(5):668-672.

[2] SONG Shaofu, ZHANG Zhongzhi, LI Shuyuan. Progress of microbial enhanced oil recovery in laboratory investigation[J]. Petroleum Science, 2004, 1(4):23-30.

[3] BEAL R, BETTS W B. Role of rhamnolipid biosurfactants in the uptake and mineralization of hexadecane inPseudomonasaeruginosa[J]. Journal of Applied Microbiology, 2000, 89:158-168.

[4] CUNNINGHAM A B, SHARP R R, CACCAVO J F, et al. Effects of starvation on bacterial transport through porous media[J]. Advances in Water Resources, 2007, 30:1583-1592.

[5] 侯百友,孫玉梅,楊冠科,等. 烴降解菌HB29產(chǎn)糖脂發(fā)酵條件的研究[J]. 中國(guó)釀造, 2009(2):83-85.

[6] 陳延君,王紅旗,王然,等. 鼠李糖脂對(duì)微生物降解正十六烷以及細(xì)胞表面性質(zhì)的影響[J]. 環(huán)境科學(xué), 2007, 28(9):2117-2122.

[7] 劉曄,周衛(wèi)民,牟伯中,等. 長(zhǎng)鏈烷烴降解菌的降解特性[J]. 微生物學(xué)雜志, 2005, 25(6):14-18.

[8] 嚴(yán)復(fù),彭志英,郭勇,等. 生物化學(xué)[M]. 北京:輕工業(yè)出版社, 1980.

[9] 張明露,馬挺,李國(guó)強(qiáng),等. 一株耐熱石油烴降解菌的細(xì)胞疏水性及乳化﹑潤(rùn)濕作用研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(9):1348-1352.

[10] 張凡,佘躍惠. 排油圈法對(duì)生物表面活性劑的定性與定量[J]. 化學(xué)工程師, 2005(1):14-18.

[11] BICCA F C, FLECK L C, AYUB M A Z. Production of biosurfactant by hydrocarbon degradingRhodococcusruberandRhodococcuserythropolis[J]. Revista de Microbiologia, 1999, 30:231-236.

[12] 李清心. 鼠李糖脂合成酶Rh1A和Rh1B基因的克隆、表達(dá)、純化及在石油微生物中的表達(dá)和應(yīng)用研究[D]. 濟(jì)南:山東大學(xué), 2005.