大學(xué)《生物化學(xué)》中“蛋白質(zhì)的沉淀及變性”實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的探索

陳仕學(xué)

（ 銅仁學(xué)院 生物科學(xué)與化學(xué)系，貴州 銅仁 554300 ）

大學(xué)《生物化學(xué)》中“蛋白質(zhì)的沉淀及變性”實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的探索

陳仕學(xué)

（ 銅仁學(xué)院 生物科學(xué)與化學(xué)系，貴州 銅仁 554300 ）

對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀及變性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了探索，結(jié)果表明：蛋白質(zhì)溶液濃度適當(dāng)是蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析及沉淀的前提，但操作方式也同樣重要，操作時(shí)不宜振蕩試管；對(duì)于乙醇引起蛋白質(zhì)沉淀及變性的實(shí)驗(yàn)，則需調(diào)整配制比例為新鮮雞蛋清：水=1：6，同時(shí)需要改變?cè)噭┑奶砑禹樞?。采用上述調(diào)整后實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象比較明顯，改善了實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

蛋白質(zhì)； 沉淀； 變性； 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)

蛋白質(zhì)的沉淀及變性實(shí)驗(yàn)是大學(xué)《生物化學(xué)》實(shí)驗(yàn)課中一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)?zāi)苁箤W(xué)生掌握蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀反應(yīng)的原理，并且掌握蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀及變性的影響因素，加深對(duì)理論知識(shí)的理解，同時(shí)讓學(xué)生明白蛋白質(zhì)沉淀及變性的應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中，筆者依照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)中的新鮮雞蛋清：水=1：9比例配制蛋白質(zhì)溶液，與各種試劑反應(yīng)，并未看到有明顯的沉淀產(chǎn)生，沒(méi)有達(dá)到實(shí)驗(yàn)教學(xué)的預(yù)期目的。在此，筆者針對(duì)蛋白質(zhì)溶液的比例和操作方式作了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，并將其實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了總結(jié)。

1．試劑與方法

1．1．試劑

配制不同比例的蛋白質(zhì)溶液，分別為新鮮雞蛋清：水=1：9；1：8 ；1：7；1：6。

1．2．操作方式

1．2．1．振蕩和不振蕩

1．2．2．對(duì)試劑量的改進(jìn)

1．2．3．所加試劑先后順序的改進(jìn)

1．2．4．石蕊試紙檢驗(yàn)酸、堿中和性

1．3．基本操作方法

按照各實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)上“蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)”實(shí)驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行。

2．結(jié)果分析與討論

2．1．結(jié)果記錄見(jiàn)表1、表2

2．1．1．各試劑與蛋白質(zhì)溶液（按新鮮雞蛋清：水=1：9比例配制）的反應(yīng)

用新鮮雞蛋清：水=1：9比例配制的蛋白質(zhì)溶液作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)蛋白質(zhì)的鹽析、重金屬銀沉淀蛋白質(zhì)、有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)和有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并對(duì)其方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2．1．2．不同比例的蛋白質(zhì)溶液對(duì)乙醇引起的沉淀及變性

分別用新鮮雞蛋清：水=1：9；1：8 ；1：7；1：6的蛋白質(zhì)溶液對(duì)乙醇引起的沉淀及變性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由實(shí)驗(yàn)可知，新鮮雞蛋清：水=1：9；1：8 ；1：7的蛋白質(zhì)溶液對(duì)乙醇引起的沉淀及變性現(xiàn)象都不明顯，即各部反應(yīng)均無(wú)沉淀產(chǎn)生，而且酸堿中和后也無(wú)沉淀產(chǎn)生，然而用新鮮雞蛋清：水=1：6比例配制的蛋白質(zhì)溶液作為實(shí)驗(yàn)材料來(lái)做該實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)中各部現(xiàn)象都很明顯。由此得出，所用蛋白質(zhì)溶液中新鮮雞蛋清：水的最佳比例為1：6，記錄結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

2．2．結(jié)果分析

2．2．1．對(duì)蛋白質(zhì)試劑比例的改進(jìn)

很多資料表明，用新鮮雞蛋清：水=1：9的蛋白質(zhì)溶液作為本實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)試劑是好材料，其原因是雞蛋易得到，易配制比例，耗量又少。但是學(xué)生在做本實(shí)驗(yàn)時(shí)，用此比例的蛋白質(zhì)溶液為材料，常?？床坏矫黠@的現(xiàn)象，原因是只見(jiàn)到渾濁現(xiàn)象，未見(jiàn)明顯的沉淀生成，同時(shí)筆者也用該比例進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與學(xué)生的結(jié)論相同。與此同時(shí)，又配制新鮮雞蛋清與水的比例為1：8；1：7；1：6的蛋白質(zhì)溶液，分別與各種試劑反應(yīng)。結(jié)果表明：在蛋白質(zhì)的鹽析、重金屬銀沉淀蛋白質(zhì)、有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)和有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，所用的蛋白質(zhì)溶液中新鮮雞蛋清：水的比例為1：9，只要不振蕩試管，各反應(yīng)中沉淀的生成是很明顯的。但是，在乙醇引起的沉淀及變性中，所用的新鮮雞蛋清：水為1：9的比例經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證得知， 3號(hào)管有較明顯的現(xiàn)象，但是1號(hào)管和2號(hào)管分別用醋酸和Na2CO3溶液中和后均無(wú)沉淀產(chǎn)生。于是，為了增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的直觀性，筆者依次又以不同比例的蛋白質(zhì)溶液作為實(shí)驗(yàn)材料（1：8 ；1：7；1：6），對(duì)乙醇引起的沉淀及變性進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：只有新鮮雞蛋清與水按1：6得比例進(jìn)行時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)1號(hào)管和2號(hào)管分別用醋酸和碳酸鈉溶液中和后產(chǎn)生了明顯的絮狀沉淀，而且此沉淀在加入0.1molL鹽酸后已溶解。

表1 蛋白質(zhì)溶液（按新鮮雞蛋清：水=1：9比例配制）與各試劑在不同方法下產(chǎn)生沉淀反應(yīng)的現(xiàn)象

表2 向盛有1ml蛋白質(zhì)溶液（按新鮮雞蛋清：水=1：6比例配制)的3支試管中加入溶劑情況

由此可知，以新鮮雞蛋清：水=1：6比例配制的蛋白質(zhì)溶液作為乙醇引起的沉淀及變性試劑，是很理想的蛋白質(zhì)試劑。同時(shí)與其他比例的蛋白質(zhì)試劑相比較，在各個(gè)環(huán)節(jié)現(xiàn)象都很明顯，尤其是在中和后觀察沉淀的生成更加明顯，這樣既可以提高實(shí)驗(yàn)效果，又便于學(xué)生理解。

2．2．2．對(duì)實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

2．2．2．1．對(duì)操作方法的改進(jìn)（振蕩和不振蕩比較）

在蛋白質(zhì)的鹽析、重金屬銀沉淀蛋白質(zhì)、有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)和有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)所用的蛋白質(zhì)溶液中新鮮雞蛋清：水的比例均為1：9。按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的要求是向各管先加好試劑后，振蕩混合均勻，靜置，再觀察沉淀的生成。通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，學(xué)生們都只能看到各管的渾濁現(xiàn)象，而看不到明顯的沉淀產(chǎn)生，于是筆者在實(shí)驗(yàn)中對(duì)其方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，即以新鮮雞蛋清：水=1：9的比例配制的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行多次不振蕩觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不振蕩，直接靜置，能夠很清楚地觀察到各管沉淀的生成，而且產(chǎn)生的沉淀在管底，有的還形成環(huán)浮于液面上方。

由此可知，在蛋白質(zhì)的鹽析、重金屬銀沉淀蛋白質(zhì)、有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)和有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)所用的蛋白質(zhì)溶液中，新鮮雞蛋清：水的比例均為1：9，操作時(shí)需采用的方法是，不振蕩，直接靜置觀察，各管現(xiàn)象非常明顯。

2．2．2．2．對(duì)沉淀劑用量的改進(jìn)

在重金屬銀沉淀蛋白質(zhì)、有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)所需試劑的量作適當(dāng)改進(jìn)，即AgNO3溶液只需加1滴（原來(lái)1~2滴，學(xué)生常會(huì)加到2滴），就能清楚地看到沉淀的生成，而且形成一團(tuán)塊于試管底部，有明顯的上清液產(chǎn)生，便于下一步操作。若在實(shí)驗(yàn)中加入2滴AgNO3溶液，不但浪費(fèi)試劑，而且還影響觀察，無(wú)明顯的沉淀產(chǎn)生。

三氯乙酸溶液的量只需加0.5ml，就可以清楚看到沉淀產(chǎn)生于試管底部, 并且有明顯的上清液產(chǎn)生，為了便于下一步操作。通過(guò)這樣改進(jìn)，既節(jié)省了試劑，又加強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的觀察效果。

2．2．2．3．所加試劑先后順序的比較

蛋白質(zhì)的鹽析實(shí)驗(yàn)中，先加蛋白質(zhì)溶液或飽和硫酸銨溶液，只要不振蕩，直接靜置觀察，現(xiàn)象都很明顯；但是，通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)表明：重金屬銀沉淀蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中，不能先加AgNO3溶液，再加蛋白質(zhì)溶液，否則看不見(jiàn)沉淀的生成；因此，操作時(shí)必須先加蛋白質(zhì)溶液，后加AgNO3溶液，沉淀反應(yīng)才明顯。然而在有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻表明：應(yīng)當(dāng)先加三氯乙酸溶液，再加蛋白質(zhì)溶液，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象才更加明顯。

因此，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，對(duì)所加試劑的先后順序需作如上改進(jìn)。即：重金屬銀沉淀蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中，必須先加蛋白質(zhì)溶液，后加AgNO3溶液，現(xiàn)象才明顯，而在有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)中，應(yīng)當(dāng)先加三氯乙酸溶液，再加蛋白質(zhì)溶液，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象才更加明顯。

2．2．2．4．檢驗(yàn)反應(yīng)的中和性

用以新鮮雞蛋清：水=1：6比例配制的蛋白質(zhì)溶液做乙醇引起的沉淀及變性實(shí)驗(yàn)時(shí)，用紅、藍(lán)石蕊試紙直接檢驗(yàn)酸、堿是否完全中和，沉淀是否能夠再生成及再溶解，現(xiàn)象都非常明顯。

3．討論

通過(guò)多次操作本實(shí)驗(yàn)，得知要做好本實(shí)驗(yàn)，需注意蛋白質(zhì)溶液的合適比例和基本操作方法，最后得出以下幾點(diǎn)重要的結(jié)論及改進(jìn)意見(jiàn)：

（1）蛋白質(zhì)的鹽析、重金屬銀沉淀蛋白質(zhì)、有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)和有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)所用的的蛋白質(zhì)溶液中，新鮮雞蛋清：水的比例均為1：9。乙醇引起的沉淀及變性實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)溶液中新鮮雞蛋清：水的比例為1：6，現(xiàn)象很明顯。各步反應(yīng)操作時(shí)，試劑加入后不振蕩，沉淀更明顯，否則只能見(jiàn)到渾濁現(xiàn)象。

（2）重金屬銀沉淀蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)表明：AgNO3溶液只需加1滴就能清楚地看到沉淀的生成，而且形成一團(tuán)塊于試管底部，有明顯的上清液產(chǎn)生，便于下一步操作。若加2滴AgNO3溶液，由于產(chǎn)生的沉淀過(guò)多，分不出上清液，不利于下一步操作。而且此實(shí)驗(yàn)中，操作不能先加AgNO3溶液，再加蛋白質(zhì)溶液，否則看不見(jiàn)沉淀生成。

（3）有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)表明：三氯乙酸溶液的量只需加0.5ml，就可明顯地看到試管底部有沉淀產(chǎn)生。如果先加三氯乙酸溶液，再加蛋白質(zhì)溶液產(chǎn)生沉淀的速度更快量也更多，故建議先加三氯乙酸溶液，且控制加入的三氯乙酸的量為0.5ml，再加入蛋白質(zhì)溶液。

[1] 王秀奇，李淑媛，高天慧等．基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（第2版）．北京：高等教育出版社，2008年．

[2] 陳鈞輝，陶力，李俊等．生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（第3版）．北京：科學(xué)出版社，2007年．

[3] 魏群，李森，井健等．基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)(第3版) ．北京：高等教育出版社，2009年．

Abstract:The experiment of the protein precipitation and denaturation has been carried out, and the results showed that the premise of the protein salting out and the precipitation is a suitable concentration of protein solution, but the operating mode is also important. It is not suitable to vibrate the test tube when operating. In the experiment of protein precipitation and the denaturation, configuration proportion needs to be adjusted. The ratio should be fresh chicken egg white: water (1: 6). Simultaneously, the ratio needs to change the increase order of the reagent. After using the above adjustment, the experiment phenomenon is obvious, and the experiment teaching effect is improved.

Key words:protein; precipitation; denaturation; improvement of experiment exploration

（責(zé)任編輯 毛志）

The Exploration of the Experiment Improvement of the Protein Precipitation and Denaturation in the University Biochemistry Textbook

Chen Shi-xue
( Department of Biological Science and Chemistry, Tongren University, Tongren, Guizhou 554300, China )

O6-3

A

1673-9639 (2010) 05-0135-03

2010-08-24

陳仕學(xué)（1976-），女，貴州銅仁人，銅仁學(xué)院講師，在讀碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究。