白鷺大腸埃希菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)*

楊澤曉,龐 歌,王 印,姚學(xué)萍,張彥明,楊增岐,汪開(kāi)毓*,楊 波

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,四川雅安 625014;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵 712100;3.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,河南中牟 451450;4.動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川雅安 625014)

自1935年人工合成磺胺類(lèi)抗菌藥物后,抗菌藥物就逐步被大量用于動(dòng)物生產(chǎn)和疫病治療[1]。但是由于抗菌藥的廣泛應(yīng)用和不科學(xué)使用,細(xì)菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重,應(yīng)用新的抗生素,就有新的耐藥菌株出現(xiàn)[2],抗生素的選擇壓力愈來(lái)愈大,加之耐藥性引起的內(nèi)源性感染、二重感染等問(wèn)題使曾經(jīng)被譽(yù)為“細(xì)菌病最強(qiáng)大武器”的抗生素陷入耐藥困境,因此細(xì)菌耐藥性成為全球關(guān)注的一個(gè)研究熱點(diǎn)。其中大腸埃希菌作為大多數(shù)動(dòng)物腸道生理菌群和環(huán)境中的常在菌[3],是耐藥性擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的重要細(xì)菌之一。研究表明,大腸埃希菌其耐藥性隨著散播到環(huán)境中的耐藥菌株,可通過(guò)質(zhì)粒傳遞等的作用產(chǎn)生多重耐藥性和交叉耐藥性,也能通過(guò)水源、食品等再傳播給動(dòng)物和人類(lèi)。因此,很多發(fā)達(dá)國(guó)家將動(dòng)物源大腸埃希菌的耐藥性作為抗菌藥物選擇壓力和進(jìn)行細(xì)菌耐藥性相關(guān)研究的重要參考指標(biāo)[4-5],目前國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)人工飼養(yǎng)畜禽大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測(cè)的相關(guān)研究較多[6-11],發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象非常普遍而且存在嚴(yán)重的多重耐藥問(wèn)題,但是對(duì)環(huán)境中和野生動(dòng)物領(lǐng)域大腸埃希菌耐藥性檢測(cè)的報(bào)道甚少。為了解野生動(dòng)物源大腸埃希菌的耐藥情況,本研究對(duì)四川省雅安市野生白鷺新鮮糞便進(jìn)行大腸埃希菌分離鑒定,并使用30種常用抗菌藥物對(duì)其耐藥性進(jìn)行了檢測(cè),以期為我國(guó)進(jìn)行大腸埃希菌耐藥性的流行和發(fā)展的相關(guān)研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)樣品 無(wú)菌采集雅安市雨城區(qū)野生白鷺新鮮糞便。

1.1.2 試劑 普通肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、鮮血平板、麥康凱平板等按常規(guī)方法[12]制備;標(biāo)準(zhǔn)藥敏試紙和微量生化試管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化 將采集的白鷺糞便接種于預(yù)先制備好的血平板37℃培養(yǎng)24 h,挑取不同菌落,革蘭染色,鏡檢,通過(guò)平板劃線法進(jìn)行細(xì)菌分離純化。

1.2.2 細(xì)菌的培養(yǎng)特性與生化鑒定 將分離菌株分別接種于普通肉湯、普通平板、血平板、麥康凱等培養(yǎng)基37℃24 h進(jìn)行培養(yǎng)特性觀察。根據(jù)微量生化發(fā)酵管說(shuō)明書(shū)按照文獻(xiàn)[13]取純化菌株肉湯培養(yǎng)物分別接種尿素酶、VP、MR、葡萄糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、木糖、硫化氫、枸櫞酸、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、乳糖等生化管和三糖鐵試驗(yàn),并挑單個(gè)菌落進(jìn)行觸酶試驗(yàn)。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 采用Kirby-Bauer法按照我國(guó)衛(wèi)生部紙片法抗菌藥敏感試驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T125-1999)進(jìn)行操作,將分離純化的大腸埃希菌挑取單個(gè)典型菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)16 h～24 h,用無(wú)菌棉拭子蘸取含菌培養(yǎng)液,均勻涂布在M-H培養(yǎng)板上,然后輕輕貼上藥敏紙片,37℃培養(yǎng)16 h～18 h測(cè)量抑菌圈直徑,根據(jù)藥敏試驗(yàn)抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)(WS/T125-1999)判定其對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定與培養(yǎng)結(jié)果

分離到的3株革蘭陰性細(xì)菌,分別編號(hào)為E1、E2和E3,鏡檢可見(jiàn)兩端鈍圓,散在或成對(duì)的紅色小桿菌;3株純化細(xì)菌均在普通平板上為光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、中間凸起、中等大小的白色菌落,麥康凱瓊脂上長(zhǎng)出紅色菌落;在營(yíng)養(yǎng)肉湯中均勻混濁,液面有菌膜,血平板上有輕微的溶血。3株細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果均顯示,葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇、山梨醇、鳥(niǎo)氨酸、賴(lài)氨酸、甲基紅、吲哚、觸酶為陽(yáng)性反應(yīng),尿素酶、側(cè)金盞花醇、苯丙氨酸酶、VP、枸櫞酸鹽反應(yīng)陰性,三糖鐵試驗(yàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣,H2 S陰性,符合大腸埃希菌的生化特征[14]。

2.2 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知,3株白鷺大腸埃希菌都對(duì)青霉素G、復(fù)方阿莫西林、萬(wàn)古霉素和潔霉素耐受,對(duì)受試的氨基苷類(lèi)抗生素、喹諾酮類(lèi)藥物和復(fù)方新諾明敏感,對(duì)四環(huán)素中度敏感。除針對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的青霉素G、萬(wàn)古霉素、潔霉素和紅霉素外還存在一定多重耐藥性,對(duì)受試常用抗菌藥物耐藥性平均2重以上。

表1 3株細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table1 The drug suscep tibility test resultsof 3 isolates

3 討論

隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,抗菌藥物不斷大量使用,細(xì)菌耐藥性不斷產(chǎn)生并且越來(lái)越嚴(yán)重,尤其大腸埃希菌耐藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散,不僅大大增加了大腸桿菌病治療難度,而且造成動(dòng)物源食品的安全問(wèn)題,還給整個(gè)生物界帶來(lái)很大的負(fù)面影響,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。我國(guó)對(duì)動(dòng)物領(lǐng)域抗菌藥物耐藥性監(jiān)測(cè)起步較晚,雖然近些年很多學(xué)者對(duì)飼養(yǎng)畜禽大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測(cè)進(jìn)行了大量研究,但是還缺乏有計(jì)劃的、系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)體系。雷連成等[8]對(duì)由患病動(dòng)物分離的146株大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測(cè)的結(jié)果顯示,受試菌株耐藥譜較廣,對(duì)試驗(yàn)用18種抗生素,最少的耐藥3種,最多的耐藥15種,平均達(dá)7種。姜中其等[9]報(bào)道60株受檢大腸埃希菌菌株中除1株外,其余59株均對(duì)2種或多種抗生素耐藥。本試驗(yàn)對(duì)從3份野生白鷺新鮮糞便分離的3株大腸埃希菌的耐藥性檢測(cè)結(jié)果表明,3株分離大腸埃希菌除針對(duì)G+細(xì)菌的青霉素G、萬(wàn)古霉素、潔霉素和紅霉素外,平均可以耐受2種以上受試抗菌藥物,提示該區(qū)野生白鷺大腸埃希菌已經(jīng)存在一定多重耐藥性。因此,野生動(dòng)物作為人類(lèi)環(huán)境中重要組成部分其來(lái)源大腸埃希菌耐藥性的監(jiān)測(cè)還是應(yīng)該引起人們重視的。

李玲等[10]對(duì)36株豬源大腸埃希菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果表明對(duì)阿莫西林耐藥率達(dá)100%;鹿淑梅等[15]對(duì)所分離的一株高致病性大腸埃希菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果表明對(duì)氯霉素高度敏感而耐受青霉素;袁洪斌等[16]分離到一株雛雞源大腸埃希菌對(duì)氯霉素、卡那霉素高敏,耐受青霉素的報(bào)道與本研究分離的3株大腸埃希菌耐藥性相一致。但是,袁洪斌等[15-16]報(bào)道的對(duì)磺胺類(lèi)藥物耐受;林居純等[11]報(bào)道的禽源或豬源大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物較高耐受率的結(jié)果與3株受檢白鷺大腸埃希菌對(duì)復(fù)方新諾明和氟喹諾酮類(lèi)藥物高度敏感的結(jié)果差異較大,這可能與人工飼養(yǎng)過(guò)程相應(yīng)抗菌藥物的使用有一定的關(guān)系。

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