黃藤素納米粒的制備及抗感染試驗(yàn)*

李云讓,歐陽(yáng)五慶,吳旭錦,李樹鵬,王 珊

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵 712100;2.寶雞職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西寶雞 721013;3.咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西咸陽(yáng) 712000;4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北保定 073000)

黃藤素(fibrauretin)為從防己科植物黃藤干燥莖中提取得到的生物堿,其有效化學(xué)成分為鹽酸巴馬汀(C21H22NO4HCl),本品具有抗細(xì)菌、真菌、瘧原蟲和腫瘤作用[1-3],常用于泌尿生殖道感染如陰道炎、呼吸道感染如肺炎、消化道感染如菌痢和腸炎等的治療。黃藤素的胃腸道吸收效果差(吸收速率小于10%)[4],嚴(yán)重影響其臨床應(yīng)用的效果。納米粒作為新的藥物載體具有提高生物利用度、調(diào)節(jié)釋藥速度、靶向性等優(yōu)點(diǎn),已成為近年研究的熱點(diǎn)[5-6]。藥物借助納米粒的包裹或者吸附作用,按與微生物類似的途徑(融合、內(nèi)吞)進(jìn)入胞內(nèi),從而增強(qiáng)黃藤素在胃腸道的吸收,達(dá)到提高生物利用度的目的。另外,納米粒通過(guò)親水性的外表減少血漿蛋白的吸附,使吞噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)藥物的清理作用下降,從而延長(zhǎng)藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間達(dá)到緩釋作用。本試驗(yàn)以乳化聚合法制備黃藤素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒(F-PBCA-NP),并通過(guò)抗感染試驗(yàn)對(duì)其藥效進(jìn)行初步評(píng)價(jià),為黃藤素納米粒制劑的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 金黃色葡萄球菌,西北農(nóng)林科技大學(xué)微生物教研室保存;昆明種小鼠,第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;黃藤素片,云南金柯制藥有限公司產(chǎn)品,批準(zhǔn)文號(hào)Z20063500;黃藤素膠囊,上海華源安徽仁濟(jì)制藥有限公司產(chǎn)品,批準(zhǔn)文號(hào)Z20050636;黃藤素原料藥,含量＞95%,云南玉溪萬(wàn)方天然藥物有限公司產(chǎn)品;氰基丙烯酸正丁酯(BCA),北京瞬康醫(yī)用膠有限公司產(chǎn)品,批號(hào)061103;泊洛沙姆F-68,上海七葉樹貿(mào)易有限公司產(chǎn)品;焦亞硫酸鈉,分析純,天津市登峰化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;磷酸鹽緩沖液,用分析試劑純自制;其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要器材 EB-280型電子天平,日本Shimadzu公司產(chǎn)品;78HW-1型恒溫磁力攪拌器,杭州儀表電機(jī)廠產(chǎn)品;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品;Optima L-100XP超速離心機(jī),美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品;UV-2102PCS型紫外分光光度計(jì),尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品;2000HSA型激光粒度分析儀,英國(guó)Mavlern公司產(chǎn)品;H-600型透射電子顯微鏡,日本日立公司產(chǎn)品;SKP02.420電熱恒溫培養(yǎng)箱,黃山市恒豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品;BCD-208 K/ACJN型冰箱,青島海爾股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 F-PBCA-NP制備 精確稱取黃藤素0.1 g加到20 mL蒸餾水中,在30℃恒溫水浴中加熱溶解配成A液。準(zhǔn)確稱取表面活性劑右旋糖酐D-70 0.2 g分散在20 mL蒸餾水中加熱溶解,冷卻后再加入表面活性劑泊洛沙姆 F-68 0.2 g,加蒸餾水至80 mL配成B液。A液和B液分別用0.1 mol/L鹽酸調(diào)pH至2.0,在攪拌條件下將0.2 g氰基丙烯酸正丁酯(BCA)緩慢滴入B液中,攪拌20 min后再將A液逐步加入,在磁力攪拌器上攪拌7 h,加入附加劑Na2S2050.2 g繼續(xù)攪拌3 h后用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至5.0,用孔徑為0.45 μ m微孔濾膜抽濾,即得F-PBCA-NP溶液。

1.2.2 F-PBCA-NP質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.2.2.1 外觀形態(tài)及粒徑 F-PBCA-NP溶液加蒸餾水作適當(dāng)分散后,取1滴～2滴置于覆有支持膜的銅網(wǎng)上停留2 min～3 min,滴入2%磷鎢酸溶液,染色2 min～3 min,自然干燥,在透射電鏡下觀察納米粒的形態(tài)。另取適量F-PBCA-NP溶液加去離子水稀釋至適當(dāng)濃度,用激光粒度分析儀測(cè)定粒徑。

1.2.2.2 包封率和載藥量 F-PBCA-NP溶液經(jīng)低溫超速離心(4℃,25 000 r/m,150 min)后,用紫外分光光度計(jì)在273 nm處測(cè)定上清液中黃藤素的含量,按下式計(jì)算黃藤素納米粒的包封率和載藥量。

其中W1為投藥量,W2為上清液中藥量,WBAC為高速離心后烘干至恒重的BCA量。

1.2.3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化制備條件 采用正交設(shè)計(jì)對(duì)影響載藥納米粒形態(tài)、粒徑、載藥量和包封率的主要因素進(jìn)行優(yōu)選,確定制備黃藤素納米粒的最佳條件。即以黃藤素濃度(A),BCA用量(B),右旋糖酐-70+泊洛沙姆F-68(1∶1)用量(C)為試驗(yàn)因素,各取3個(gè)水平,采用L9(34)表安排試驗(yàn)(表1)。對(duì)各次試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分[7],形態(tài)分(X1,滿分10):從樣本電鏡照片中選出清晰的三張觀察,以分散性好、圓整、均勻而不粘連者為佳適當(dāng)給分;粒度分(X2):X2=X/SD,X為平均粒徑,SD為樣本偏差;包封率分(X3,滿分 10):實(shí)測(cè)包封率×10;載藥量分(X4,滿分10):實(shí)測(cè)載藥量×10;總分(X):X=X1+X2+X3+X4。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果T able 1 Design and result of orthogonal test

1.2.4 抗感染試驗(yàn)

1.2.4.1 菌液制備與動(dòng)物分組 將金黃色葡萄球菌接種于10 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,在37℃恒溫箱中孵育增菌18 h后作為感染原菌液;將原菌液用生理鹽水稀釋至感染動(dòng)物所需濃度即1×109/mL[8]。選體重18 g～22 g的健康小鼠并雌雄各半,將小鼠隨機(jī)分為7組且每組10只即黃藤素片劑組、黃藤素膠囊組、空白納米粒組;黃藤素納米粒組、陰性對(duì)照組(感染金葡菌而不給藥物或感染后給予生理鹽水)和陽(yáng)性對(duì)照組(感染后給予鹽酸諾氟沙星)及正常對(duì)照組(不感染金葡菌也不給藥物),灌服劑量為黃藤素70 mg/kg。

1.2.4.2 感染模型的建立和治療 選取經(jīng)飼養(yǎng)7 d～10 d后的清潔健康小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物,試驗(yàn)小鼠除正常對(duì)照組外每組小鼠腹腔注入金黃色葡萄球菌0.5 mL,于感染后即刻 6、12、24、48 、72 h 給各組小鼠分別灌胃相應(yīng)的藥物[9],連續(xù)觀察并記錄感染后7 d內(nèi)小鼠的死亡數(shù);死亡小鼠及時(shí)解剖而存活小鼠在末次給藥后的次日斷頸處死均取心、肝、脾和肺及腎稱重以計(jì)算臟器重量指數(shù)[10]。

2 結(jié)果

2.1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選的制備條件

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果(表1),極差(R)確定主次因素順序:C＞B＞A。其中A因素:K1＞K2＞K3;B因素:K2＞K1＞K3;C因素:K3＞K1＞K2,因此確定A1B2C3為最佳處方。故制備黃藤素納米粒的最佳條件為黃藤素1.5 mg/mL;氰基丙烯酸正丁酯2.0 mg/mL;右旋糖酐-70+泊洛沙姆F-68(1∶1)4.0 mg/mL。按優(yōu)化條件制備黃藤素納米粒形態(tài)圓整、表面光滑、大小均勻、納米粒之間無(wú)粘連(圖1);平均粒徑為64 nm,載藥量50.9%,包封率67.8%。

2.2 抗感染作用

由表2可知黃藤素納米粒可提高感染金葡菌小鼠的存活率達(dá)到80%,而片劑和膠囊分別為30%和40%,體內(nèi)抗菌消炎效果不遜于鹽酸諾氟沙星且這種效應(yīng)具有劑量依賴性。

表3顯示小鼠感染后心臟和肺臟及腎臟的重量指數(shù)沒(méi)有變化而肝臟和脾臟重量指數(shù)上升;在同等劑量條件下黃藤素納米粒制劑能降低肝臟和脾臟的重量指數(shù),特別是降低脾臟重量指數(shù)的效果明顯高于普通制劑(P＜0.05),空白納米粒對(duì)臟器指數(shù)沒(méi)有影響。

圖1 電鏡檢測(cè)的納米粒形態(tài)圖(×100 000)Fig.1 F-PBCA-NP by transmission electron microscope(×100 000)

表2 黃藤素納米粒對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠的保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Protective test results of fibrauretin nanoparticle against S.aureas in mice

表3 黃藤素納米粒對(duì)細(xì)菌感染小鼠臟器重量指數(shù)影響的結(jié)果Table 3 Effects of F-NP on organ weight indexes in bacterialinfection mice

3 討論

3.1 納米粒的制備

在載藥聚氰基丙烯酸烷酯納米粒的制備過(guò)程中,溫度和攪拌速度對(duì)納米粒的成球性和粒徑無(wú)明顯影響。由于BCA的聚合是以H2O中的OH-作為引發(fā)劑的,所以控制介質(zhì)pH是制備納米粒成敗的關(guān)鍵。附加劑的種類和用量可以改變納米粒表面的電荷性質(zhì)而影響藥物的吸附。所以結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[11-12],這些條件很容易確定。表面活性劑不僅影響納米粒的質(zhì)量參數(shù),還對(duì)成球后的納米粒有穩(wěn)定作用。藥物/BCA的比率影響納米粒的載藥量和包封率,故處方優(yōu)化應(yīng)以這3個(gè)因素為重點(diǎn)。乳化劑F-68和D-70單獨(dú)使用時(shí),納米粒的球形不規(guī)則且粒徑分布較寬,原因可能在于F-68+D-70的親水親油平衡值(HLB)更利于單體BCA的分散,其用量與納米粒的粒徑成負(fù)相關(guān),但當(dāng)用量達(dá)到一定程度后,粒徑的變化不明顯,并且整個(gè)納米粒體系的載藥量下降,故表面活性劑的用量一般控制在3%左右。藥物和BCA由于水溶性的限制,用量一般都小于1%,增大藥物與BCA的比率會(huì)使載藥量提高而包封率下降,所以兩者的比例要適中。由于藥物理化性質(zhì)有差異,會(huì)使其與其他藥物的制備條件不盡相同,所以要通過(guò)試驗(yàn)尋找適合本藥物的制備方法。

3.2 抗感染作用

金黃色葡萄球菌是醫(yī)院內(nèi)感染最重要的感染原也是社區(qū)感染的常見病原菌,研究發(fā)現(xiàn)金葡菌對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥,這給臨床治療帶來(lái)極大困難[13]?？咕鷻C(jī)制不同于β-內(nèi)酰胺類抗生素的純中藥提取物黃藤素常作為抗菌消炎藥用于敏感菌引起的感染,特別對(duì)革蘭陽(yáng)性菌中金黃色葡萄球菌的抑制效果最好,故本試驗(yàn)選用金葡菌腹腔感染造模。盡管納米化后的藥物可能具有許多新的特性,但納米化過(guò)程是否會(huì)影響抗菌藥物的原有特性尤其是抗菌活性,是令人關(guān)注和感興趣的問(wèn)題也是抗菌藥物納米化必須回答的問(wèn)題。本試驗(yàn)通過(guò)黃藤素納米化前后對(duì)染菌小鼠治療效果的觀察,發(fā)現(xiàn)與普通制劑相比較,黃藤素納米粒不僅能大幅提高小鼠存活率,而且能顯著降低患病小鼠脾臟的病理反應(yīng),故黃藤素納米粒的體內(nèi)抑菌效果優(yōu)于普通劑型,這與桂卉[14]研制的硫酸鏈霉素納米粒和鄒龍[15]研制的頭孢唑林鈉納米粒的抑菌結(jié)果的報(bào)道一致,原因來(lái)自黃藤素納米粒改善胃腸道吸收差的狀況從而導(dǎo)致藥效提高。

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