平文祥，趙 丹，宋 剛，葛菁萍，凌宏志

(黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080)

亞麻是天然紡織原料之一，亞麻纖維具有透氣性好等優(yōu)良性能，日益受到人們的喜愛(ài)。但在亞麻纖維中連接著大量的粘性物質(zhì)(如果膠等)，為提取其中的可紡纖維，必須在一定程度上破壞它們的連接，即進(jìn)行亞麻原莖脫膠。亞麻原莖脫膠的方法很多，主要有厭氧溫水浸漬法和雨露法。雨露法受氣候、降雨量和光照等條件的影響，多被西歐國(guó)家所采用。我國(guó)和前蘇聯(lián)主要采用的是溫水浸漬法，俗稱“漚麻”[1-2]，此法是利用麻莖及水源中微生物的自然發(fā)酵作用，產(chǎn)生果膠酶，它能將果膠分解成小分子還原糖，再通過(guò)DNS法[3-4]測(cè)定發(fā)酵液中還原糖的含量，間接反映菌株分解果膠能力的大小，該法被廣泛用于生產(chǎn)。使用生物(酶)脫膠，既能減少環(huán)境污染、改善勞動(dòng)條件和減輕對(duì)纖維的損壞，又能節(jié)約能量消耗，降低成本。針對(duì)此特點(diǎn)，對(duì)果膠酶產(chǎn)生菌HDYM-02進(jìn)行了發(fā)酵條件的初步研究和探討，并在實(shí)驗(yàn)室條件下確定其最佳培養(yǎng)方案，以期能為亞麻原莖生物(酶)脫膠的工業(yè)化生產(chǎn)服務(wù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種來(lái)源

果膠酶產(chǎn)生菌HDYM-02，由巴彥縣亞麻有限公司漚麻池中分離選育得到。

1.2 重要試劑

DNS試劑：將6.3g的3，5-二硝基水楊酸、262ml的2mol/lNaOH加到500ml含182g的酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加入5g苯酚及5g亞硫酸鈉，待溶解、冷卻后，加蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中，一周后即可使用。

1.3 培養(yǎng)基

1)種子培養(yǎng)基：液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

2)發(fā)酵培養(yǎng)基：果膠0.4%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，112℃滅菌30min。

1.4 方法

1)DNS法測(cè)定還原糖。取一定量的發(fā)酵液，6000rpm/min離心5min，再取離心上清液0.5ml移入加有0.5mlDNS試劑的試管，加4ml蒸餾水，搖勻，沸水浴中加熱5min，迅速冷卻。用分光光度計(jì)在540nm處測(cè)其吸光度值。參比液配制：離心上清液0.5ml與4.5ml蒸餾水充分混合[3]。

2)發(fā)酵種子液的制備。以兩環(huán)的接種量將分離選育得到的菌株HDYM-02接種到種子培養(yǎng)液中，37℃靜止培養(yǎng)24h。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)菌株HDYM-02分解果膠能力的影響

做溫度試驗(yàn)時(shí)采用發(fā)酵培養(yǎng)基，分別考察了在29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃時(shí)，菌株分解果膠能力的大小，測(cè)定出發(fā)酵液中還原糖的含量，結(jié)果如表1所示：發(fā)酵溫度試驗(yàn)表明，溫度對(duì)本研究所篩選的菌株HDYM-02分解果膠的能力有顯著的影響。從表1可以看出，當(dāng)發(fā)酵液溫度為33℃時(shí)，菌株HDYM-02產(chǎn)生的還原糖量最高，相對(duì)而言菌株繁殖也最快，；溫度過(guò)高或過(guò)低，均不利于菌株HDYM-02的自身生長(zhǎng)，并且產(chǎn)生的還原糖量相對(duì)低很多，所以發(fā)酵溫度選擇33℃為宜。

表1 溫度對(duì)菌株分解果膠能力的影響

2.2 初始pH值對(duì)菌株HDYM-02分解果膠能力的影響

采用發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行了不同初始pH值的發(fā)酵試驗(yàn)，用1mol/ml的NaOH或HCl調(diào)節(jié)發(fā)酵液的初始pH值，分別考察了初始pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0時(shí)，菌株HDYM-02分解果膠的能力，結(jié)果如圖1，圖2所示：

圖1發(fā)酵液初始pH值對(duì)菌濃的影響圖2發(fā)酵液初始pH值對(duì)菌株分解果膠能力的影響

不同初始pH值的發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基初始pH值不同，對(duì)菌株HDYM-02發(fā)酵分解果膠能力有顯著影響。在溫度為33℃的時(shí)候，如圖2所示，當(dāng)發(fā)酵液的初始pH值為7.0時(shí)，菌株HDYM-02在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處分解果膠產(chǎn)生還原糖的量均較高，如圖1所示，此時(shí)菌株的繁殖也較快。而當(dāng)發(fā)酵液初始pH值小于7.0時(shí)，產(chǎn)還原糖量有所下降，相對(duì)菌濃變化也不明顯，在發(fā)酵液初始pH值為4.5時(shí)，雖然還原糖產(chǎn)量在個(gè)別幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)很高，但菌濃相對(duì)較低。所以控制發(fā)酵培養(yǎng)液的初始pH值為7.0時(shí)比較適宜。

2.3 氮源對(duì)菌株HDYM-02分解果膠能力的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照各培養(yǎng)基含氮量為0.1%，分別添加豆?jié){、(NH4)2SO4、尿素、(NH4)2CO3、NH4NO3各種氮源來(lái)代替蛋白胨，并以發(fā)酵溫度33℃，初始發(fā)酵液pH值為7.0的條件對(duì)菌株HDYM-2進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果如表2所示：尿素對(duì)菌株分解果膠的能力有顯著的影響。其中,添加尿素對(duì)菌株分解果膠有利，還原糖產(chǎn)量相對(duì)較好，菌濃相對(duì)較高。另外，有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更有利于還原糖的產(chǎn)生。

2.4 鹽濃度對(duì)菌株HDYM-02分解果膠能力的影響

采用發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行了不同NaCl濃度的發(fā)酵試驗(yàn)，考察了NaCl濃度為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%時(shí)的還原糖產(chǎn)量，結(jié)果如表3所示：發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)鹽濃度為0.5%～0.7%時(shí)，菌株HDYM-02分解果膠能力相對(duì)較強(qiáng)。但是，各鹽濃度試驗(yàn)的還原糖產(chǎn)量差別不大，菌濃變化也不明顯，說(shuō)明鹽濃度試驗(yàn)對(duì)菌株分解果膠能力的影響不顯著。

表2 氮源對(duì)菌株分解果膠能力的影響

表3 鹽濃度對(duì)菌株分解果膠能力的影響

2.5 正交試驗(yàn)

在以上單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)發(fā)酵影響較大幾個(gè)因素，即發(fā)酵溫度、發(fā)酵液初始pH值、尿素三個(gè)因子做L9(33)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表4。

表4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

連續(xù)發(fā)酵60h，試驗(yàn)結(jié)果如圖3，圖4所示。針對(duì)還原糖產(chǎn)量而言，圖4顯示：

1)0～6h時(shí)，各試驗(yàn)方案的發(fā)酵液中還原糖含量均處于上升階段，其中方案3的還原糖含量相對(duì)較少，而方案5的還原糖含量最高，其余方案產(chǎn)還原糖量介于兩者之間；

2)6～24h時(shí)，有的方案如方案8，還原糖產(chǎn)量有所下降，但總體而言仍呈上升趨勢(shì)，到24h的時(shí)候，還原糖產(chǎn)量達(dá)到最大，在此階段，方案3發(fā)酵液中還原糖含量相對(duì)較低，而方案9的含量相對(duì)較高；

3)24～48h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)方案發(fā)酵液中的還原糖含量均處于下降階段。針對(duì)還原糖產(chǎn)量下降的幅度而言，方案4下降的幅度最明顯，方案2最緩慢，其余各方案還原糖量下降幅度介于兩者之間；

4)48～60h時(shí)，發(fā)酵液中的還原糖產(chǎn)量有所上升。其中，方案9及方案2的發(fā)酵液中還原糖含量相對(duì)較高。

綜合圖3，圖4分析，方案9發(fā)酵液中還原糖產(chǎn)量相對(duì)較高，菌株HDYM-02分解果膠的能力較強(qiáng)，相對(duì)的菌濃也較高，菌株HDYM-02繁殖較快，菌體長(zhǎng)勢(shì)較好。所以，筆者認(rèn)為方案9為最佳發(fā)酵條件，最佳組合為A3B3C1，即菌株HDYM-02的最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵液初始pH值6.5、尿素濃度為0.5%。

圖3 正交試驗(yàn)菌濃變化 圖4 正交試驗(yàn)還原糖量變化

3 討論

果膠酶屬于誘導(dǎo)酶，菌株HDYM-02必須在果膠物質(zhì)的誘導(dǎo)下才能產(chǎn)生原果膠酶，進(jìn)而將果膠分解，產(chǎn)生還原糖。菌株HDYM-2不能利用或者很少利用果膠，在發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)112℃滅菌后，果膠由于物理(如壓力、溫度等)作用而少量分解成小分子還原糖，菌種正是利用該部分的還原糖，產(chǎn)生果膠酶，此時(shí)菌株處于產(chǎn)酶階段，降解果膠生成還原糖，發(fā)酵液中還原糖含量增加。當(dāng)分解代謝產(chǎn)物即還原糖量達(dá)到一定值時(shí)，該代謝物阻遏果膠酶的繼續(xù)產(chǎn)生，酶合成終止，相對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液中還原糖含量也逐漸減少。隨著分解代謝物的消耗，阻遏作用被解除，果膠酶生產(chǎn)恢復(fù)正常，發(fā)酵液中的果膠被逐步分解，發(fā)酵液中還原糖量再次上升。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，再加上菌株自身產(chǎn)酶能力的退化，使得菌種產(chǎn)酶量降低，其分解生成的還原糖量也相對(duì)減少，所以，發(fā)酵過(guò)程中雖然菌濃呈上升趨勢(shì)，但產(chǎn)生的還原糖量卻始終呈波浪型分布。

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