芽胞抗力快速弱化技術(shù)研究

張 林,程立慶,黃國(guó)榮,向 穎,吳 龍,熊鴻燕

(第三軍醫(yī)大學(xué)軍隊(duì)流行病學(xué)教研室,重慶 400038)

芽胞抗力快速弱化技術(shù)研究

張 林,程立慶,黃國(guó)榮,向 穎,吳 龍,熊鴻燕＊

(第三軍醫(yī)大學(xué)軍隊(duì)流行病學(xué)教研室,重慶 400038)

以L-丙氨酸緩沖液為發(fā)芽劑,結(jié)合芬頓反應(yīng)原理,觀察發(fā)芽-氧化損傷效應(yīng)對(duì)芽胞的殺滅效果,以期為新型炭疽疫源地凈化方法的深入研究奠定基礎(chǔ)。以臘樣芽胞為試驗(yàn)菌,采用透射電鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、活菌計(jì)數(shù)等方法觀察芽胞發(fā)芽過(guò)程的超微結(jié)構(gòu)、核酸含量變化,以及在芬頓反應(yīng)的聯(lián)合作用下發(fā)芽體的活性變化。在20～30 min的發(fā)芽過(guò)程中,芽胞核心密度降低,核心與皮質(zhì)、皮質(zhì)與外壁之間界限模糊,芽胞外壁和芽胞衣有破裂,通透性增加,進(jìn)一步有皮質(zhì)消失、細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)融合、細(xì)胞膜基本形成的現(xiàn)象;發(fā)芽體熒光強(qiáng)度不斷增加,顯示菌體中核酸的活性和含量不斷增加;發(fā)芽體對(duì)化學(xué)因子的抗力明顯下降,H2O2濃度為0.20 mol/L的Fenton反應(yīng)系統(tǒng)作用60 min時(shí),發(fā)芽體滅活可達(dá)到3.016個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。誘導(dǎo)發(fā)芽和反應(yīng)的聯(lián)合處理程序可顯著提高芽胞的滅活水平。

芽胞;發(fā)芽劑;芬頓反應(yīng)

與相應(yīng)繁殖體相比,細(xì)菌芽胞對(duì)理化因素的抵抗作用增加了10～75倍,常規(guī)消毒、滅菌方法完全無(wú)法清除此類(lèi)微生物[1-5]。因此,專(zhuān)業(yè)機(jī)構(gòu)對(duì)炭疽疫源地進(jìn)行洗消處置時(shí)必須采取超常規(guī)手段,即采取焚燒加高濃度化學(xué)制劑長(zhǎng)期浸泡的方法,這些方法對(duì)環(huán)境的污染非常嚴(yán)重[6-8]。而且,根據(jù)近年來(lái)生物恐怖襲擊的特點(diǎn),生物污染地往往是在人群高度集中的場(chǎng)所,如建筑內(nèi)、運(yùn)輸工具內(nèi)和重要的交通中心等,現(xiàn)場(chǎng)洗消難度和低污染要求增加。因此,在生物防護(hù)技術(shù)研究中,探索并建立可靠、低污染型的現(xiàn)場(chǎng)凈化技術(shù)是一項(xiàng)迫切任務(wù)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸、次黃嘌呤核苷等)、非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(吡啶二羧酸鈣)、物理(壓力、磨損等)等因素能夠啟動(dòng)芽胞的萌發(fā)過(guò)程,促使其不斷生長(zhǎng),向繁殖體狀態(tài)轉(zhuǎn)變。在這一過(guò)程中,促成細(xì)菌芽胞高抵抗力的各種因素,如豐厚的殼質(zhì)層、芽胞膜內(nèi)大量吡啶二羧酸鈣(CaDPA)包裹的蛋白酶、被α/β-酸溶性小分子蛋白(α/β-type acid-soluble spore proteins,α/β-SASP)包繞的核酸成分,以及多種核酸修復(fù)酶等逐漸降解、流失。伴隨著這些反應(yīng),芽胞的通透性逐漸增加,抗力明顯降低[9-11]。這意味著在芽胞啟動(dòng)萌發(fā)程序后存在一“脆弱”期,有利于設(shè)計(jì)“致死性攻擊”方法。因此,本課題以L-丙氨酸緩沖液為發(fā)芽劑,結(jié)合芬頓反應(yīng)(Fenton reaction)原理,觀察發(fā)芽-氧化損傷效應(yīng)對(duì)芽胞的殺滅效果,以期為新型炭疽疫源地凈化方法的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 凍干臘樣芽胞(ATCC10987) 由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。

1.1.2 儀器設(shè)備 透射電鏡(荷蘭飛利浦TECNA I-10型);激光掃描共聚焦顯微鏡(TCS SP5型,德國(guó)Leica)。

1.2 方法

1.2.1 芽胞發(fā)芽處理 ①芽胞懸液制備[12]:取凍干臘樣芽胞用營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板進(jìn)行增菌和純化培養(yǎng)。取5.0 mL第3～5代菌液于羅氏瓶進(jìn)一步培養(yǎng),置于37℃恒溫箱內(nèi),培養(yǎng)5～7 d。芽胞染色,鏡檢。當(dāng)芽胞形成率達(dá)95%以上時(shí)收集芽胞。過(guò)濾芽胞懸液,清除其中的瓊脂凝塊;離心、清洗(3000 r/min離心10 min)3遍。將洗凈的芽胞懸浮于三角燒瓶?jī)?nèi)蒸餾水中,并加入適量小玻璃珠。將芽胞液放于80℃水浴中10 min,以殺滅殘余的繁殖體。待冷至室溫后,保存于4℃冰箱中備用;②L-丙氨酸發(fā)芽劑制備:將L-丙氨酸(加拿大B I O BASIC I NC)加入10 mmol/L Tris/HCl(pH 8.5)緩沖液中,使L-丙氨酸終濃度為200 mmol/L;③引導(dǎo)發(fā)芽:將稀釋于PBS緩沖液中的芽胞(107cfu/mL左右)在70℃恒溫水浴箱水浴30 min,然后37℃孵育15 min[13-15];以1∶1的比例將芽胞懸液加入發(fā)芽劑中,在室溫下作用20 min。

1.2.2 發(fā)芽過(guò)程的形態(tài)學(xué)觀察 ①透射電鏡觀察:將2～3 mL經(jīng)發(fā)芽劑處理的芽胞懸液離心(2000～2500 r/min),使芽胞成團(tuán),用適量2.5%戊二醛進(jìn)行固定。0.1 mol/L PBS漂洗2次,用1%鋨酸進(jìn)行后固定2 h,再用0.1 mol/L PBS漂洗2次,用丙酮梯度脫水后浸透包埋、脫水、切片、雙鉛染色,在透射電鏡下觀察(80 KV),每個(gè)樣本觀察20～30個(gè)視野;②激光掃描共聚焦顯微鏡觀察[16]:吸取萌發(fā)后的芽胞懸液樣本20～30μL滴加在載玻片上,用30～50μL 2.5%戊二醛進(jìn)行固定,再滴加50～100μL 100 ng/mL DAPI熒光染液(4′,6-diamidino-2-phenylindole;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚),使其覆蓋樣品,染色10 min后,用新鮮配置的PBS緩沖液輕輕沖洗2～3次,蓋上蓋玻片,在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 芬頓反應(yīng)殺菌試驗(yàn) 芬頓反應(yīng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì):按照經(jīng)典的芬頓反應(yīng)方法[17],以H2O2、Fe2+和EDTA為核心成分,制備3個(gè)芬頓反應(yīng)系統(tǒng)。3個(gè)系統(tǒng)中,H2O2濃度分別為0.05、0.1、0.2 mol/L,H2O2與Fe2+摩爾比為9∶1。稀釋液為二次去離子水。殺菌試驗(yàn):按照《消毒技術(shù)規(guī)范》要求[12],室溫下,在無(wú)菌大試管中加入0.5 mL發(fā)芽的芽胞混懸液,再加入0.5 mL有機(jī)干擾物質(zhì),混勻,置20℃水浴5 min,分別加入3種芬頓反應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)液4.0 mL與其混合,在10、30、60 min時(shí)分別取混懸液0.5 mL,置于4.5 mL 1 mmol/L二甲基亞砜液(中和劑)中,中和10 min后分別取1.0 mL進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)同時(shí),以芽胞為對(duì)象,在相同條件下進(jìn)行芬頓反應(yīng)的殺菌觀察,以作為對(duì)照觀察;此外,以芬頓反應(yīng)所用稀釋液代替芬頓反應(yīng)液,進(jìn)行平行試驗(yàn),作為空白對(duì)照組;以濃度1.00 mol/L H2O2液代替芬頓反應(yīng)液,進(jìn)行平行試驗(yàn),作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。各試驗(yàn)點(diǎn)均平行3個(gè)樣本試驗(yàn)。以上試驗(yàn)中芽胞濃度為1.8×107/mL;芽胞發(fā)芽體的濃度為1.8×107/mL。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)芽過(guò)程中芽胞的超微結(jié)構(gòu)變化觀察

從超微結(jié)構(gòu)觀察可見(jiàn)(見(jiàn)圖1),發(fā)芽20 min時(shí)的芽胞核心密度降低,核心與殼質(zhì)、殼質(zhì)與外壁之間界限模糊,芽胞外壁和芽胞衣有破裂,通透性增加;30 min時(shí)的芽胞殼質(zhì)消失,細(xì)胞膜基本形成,細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)融合。

2.2 發(fā)芽過(guò)程中菌體的超微結(jié)構(gòu)變化觀察

經(jīng)DAPI熒光染色后,隨著發(fā)芽時(shí)間的增加發(fā)芽體熒光強(qiáng)度不斷增加(見(jiàn)圖2),顯示菌體中核酸的活性和含量不斷增加。

圖1 芽胞發(fā)芽過(guò)程的超微結(jié)構(gòu)變化(37000×)Fig.1 The ultrastructure changes of spore germination(37000×) a、b、c:不同切面正常芽胞:結(jié)構(gòu)清晰,核心、皮質(zhì)、芽胞衣、外壁很完整,b圖還可見(jiàn)核心和皮質(zhì)之間的內(nèi)膜,皮質(zhì)和芽胞衣之間的外膜;d、e、f:發(fā)芽20 min的菌體:核心密度降低,核心與皮質(zhì)、皮質(zhì)與外壁之間界限模糊,芽胞外壁和芽胞衣有破裂;g、h、i:發(fā)芽30 min時(shí)菌體:芽胞皮質(zhì)消失,細(xì)胞膜基本形成,細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)融合

圖2 芽胞發(fā)芽過(guò)程中核酸熒光染色變化(1000×)Fig.2 Nucleic acid fluorescent staining changes of spore germination(1000×) a:正常芽胞;b:發(fā)芽20 min時(shí)的菌體;c:發(fā)芽30 min時(shí)的菌體

2.3 芬頓反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)芽胞和發(fā)芽體的殺滅作用

殺菌試驗(yàn)顯示,芽胞對(duì)單純的H2O2溶液有明顯的抗力,經(jīng)濃度為1.00 mol/L的H2O2溶液作用60 min時(shí)只能達(dá)到0.084個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的殺滅效果。但發(fā)芽體抗力明顯下降,相同濃度和作用時(shí)間殺滅數(shù)量達(dá)到1.229個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。與單純的H2O2溶液相比,芬頓反應(yīng)系統(tǒng)有明顯的殺菌增效作用,H2O2濃度為0.20 mol/L的在反應(yīng)系統(tǒng)中作用60 min時(shí),芽胞殺滅數(shù)量可達(dá)到0.129個(gè)對(duì)數(shù)級(jí),發(fā)芽體可達(dá)到3.016個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。

表1 芬頓反應(yīng)系統(tǒng)和單純的H2O2溶液殺菌作用Table 1 The sterilization effect of Fenton reagent and hydrogen peroxide on spore

3 討 論

發(fā)芽誘導(dǎo)與芬頓反應(yīng)系統(tǒng)的殺菌作用:細(xì)菌芽胞的高抵抗Fe2+力是與其豐厚的外壁、皮質(zhì)、芽胞膜內(nèi)大量吡啶二羧酸鈣(CaDPA)包裹的蛋白酶、被α/β-酸溶性小分子芽胞蛋白(α/β-type acid-soluble spore proteins,α/β-SASP)浸潤(rùn)的核酸成分,以及多種核酸修復(fù)酶等因素密切相關(guān)的。在萌發(fā)過(guò)程中,進(jìn)入始動(dòng)期(initiation)末時(shí),各種促成芽胞具有高抗力的因素逐漸瓦解,如CaDPA的大量外流以及α/β-SASP迅速降解,芽胞的通透性增加,抗力明顯降低。這就意味著,促使芽胞啟動(dòng)萌發(fā)過(guò)程而后進(jìn)行攻擊是殺滅芽胞的一個(gè)有效途徑。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)始利用這種原理,探索了理化因素、生物酶和噬菌體等與其聯(lián)合作用的殺菌效果,相關(guān)結(jié)果展示出可喜的應(yīng)用前景[18-20]。

本研究利用濃度為200 mmol/L L-丙氨酸發(fā)芽劑誘導(dǎo)芽胞發(fā)芽,在發(fā)芽劑作用20～30 min時(shí),芽胞核心密度降低,核心與皮質(zhì)、皮質(zhì)與外壁之間界限模糊,芽胞外壁和芽胞衣有破裂,進(jìn)一步皮質(zhì)消失,細(xì)胞核融合,細(xì)胞膜基本形成,包體核酸的活性顯著提高,菌體抗力降低,在H2O2濃度為0.2 mol/L的反應(yīng)條件下,發(fā)芽芽胞的殺滅量達(dá)到3個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)?；緦?shí)現(xiàn)了低殺菌劑濃度,高滴度滅活菌體的目標(biāo)。但是,此處理方式不能進(jìn)一步提高對(duì)菌體的殺滅程度,其原因可能是在發(fā)芽誘導(dǎo)程序中少量芽胞(10%左右)未能復(fù)蘇發(fā)芽。因此,在進(jìn)一步研究中,將探索改良發(fā)芽程序,以提高發(fā)芽率。

芬頓反應(yīng)的應(yīng)用價(jià)值:芬頓反應(yīng)[21]是利用催化劑或光輻射或電化學(xué)作用,通過(guò)H2O2產(chǎn)生羥基自由基(·OH)處理有機(jī)物的技術(shù)。系統(tǒng)中主要成分為H2O2和Fe2+,其中H2O2與Fe2+的比例一般在5～25∶1,pH 3～5。H2O2在Fe2+的催化作用下分解產(chǎn)生·OH。羥基自由基的氧化電位達(dá)到2.8 V,是除元素氟外最強(qiáng)的無(wú)機(jī)氧化劑,可通過(guò)電子轉(zhuǎn)移等途徑將有機(jī)物(羧酸、醇、酯等有機(jī)化合物)氧化分解成無(wú)機(jī)小分子,這種反應(yīng)體系即可以殺滅細(xì)菌,又可以分解有機(jī)物。

芬頓反應(yīng)中,Fe2+被氧化成Fe3+,同時(shí)分解H2O2并釋放·OH。新生成的Fe3+一部分發(fā)生水解,另一部分繼續(xù)參與反應(yīng),重新被還原成Fe2+。在此體系中,pH、H2O2濃度、Fe2+/Fe3+比例均可影響·OH水平。有研究顯示,在低Fe2+的量時(shí),增加其投加量可有效促進(jìn)羥基自由基的生成;過(guò)高濃度的Fe2+在氧化過(guò)程中,將導(dǎo)致反應(yīng)啟動(dòng)過(guò)程中雙氧水被迅速催化產(chǎn)生大量活性羥基自由基,造成游離羥基自由基的積聚,使自由基自身反應(yīng),反而影響對(duì)有機(jī)物的氧化作用[22]。本研究以細(xì)菌芽胞的發(fā)芽體為試驗(yàn)對(duì)象,經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選,從反應(yīng)效果和處理成本因素考慮,將Fe2+與H2O2摩爾比設(shè)為1∶9。研究結(jié)果可見(jiàn),在芬頓反應(yīng)中, H2O2濃度為0.2 mol/L的反應(yīng)體系可殺滅發(fā)芽芽胞體3.016個(gè)對(duì)數(shù)級(jí),而單純的H2O2溶液在濃度為1.0 mol/L時(shí)只能殺滅1.229個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。顯示系統(tǒng)中產(chǎn)生的·OH有更高的殺菌效應(yīng)。由于·OH存在濃度低、反應(yīng)活性大、壽命短,滯留的毒性和污染問(wèn)題小,因此,在深入研究進(jìn)一步提高殺滅效率的基礎(chǔ)上,將芬頓反應(yīng)與發(fā)芽劑結(jié)合,作為疫源地的洗消制劑是值得推廣的。

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Rapid Weakening Techniques of Germ Resistance

ZHANG Lin,CHENG Li-qing,HUANG Guo-rong,XIANG Ying,WU Long,XIONG Hong-yan
(Teach.&Res.Div.of Troops Epidemics,The Third Milt.Med.Uni.,Chongqing400038)

Based on the germination agent of L-alanine buffer combined with the principle of Fendun reaction,the killing result of germination-oxidation traumatic effects against germ were observed so as to lay down foundation of studying deeply on cleaning methods of the epidemic source new type of anthrax.The germ of Bacillus cereus was used as a test bacteria and observed its super microstructure of its germination process,content changes of nucleic acid through trans mission electron microscope,laser scanning confocal microscope,living cell counting etc.,as well as the activity changes of germinant body under the united effect of Fenton method.The results showed that during the germinant process in 20～30 min.the density of core were decreased and the margins between core and cortex,the bounds cortex and exospore were blurred;and there were some break at the exospore and coat,the per meability increased, some cortex vanished,nuclei and protoplasm fused,and cell membrane basically formed,and fluorescence intensity germination body continuously increased,indicating the activity and content of nucleic acid of thallus continuously increased;the resistance of germination body against chemical factor obviously decreased.After treated by Fenton reaction(0.2 mol H2O2)for 60 min,the inactivation of germination body was as high as 3.016 logarithmic level.Therefore,joint treatment procedure of germination with reaction could obviously increase the inactivation level of germs.

spore;germination agent;Fenton reaction

Q939.1

A

1005-7021(2010)06-0027-05

重慶市科委攻關(guān)課題(CSTC,2008AC5005)

張林 男,碩士研究生。主要從事傳染病流行病學(xué)研究。E-mail:monkcrazy@126.com

＊通訊作者。Tel:023-68752287,E-mail:hongyanxiong@sohu.com

2010-10-25;

2010-11-20