甲基叔丁基醚高效降解菌的分離鑒定及其生物強化技術(shù)

劉涉江，李鑫鋼，紀(jì)志永，蘇曉葉

(1. 天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津300072；2. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072)

甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether，MTBE)在生產(chǎn)、運輸、儲存過程中由于泄露等原因，進入汽車發(fā)動機的MTBE有3%～10%最終轉(zhuǎn)移到地下環(huán)境中，嚴(yán)重威脅土壤和地下水的公共安全．據(jù)美國地質(zhì)勘探局報告指出，MTBE已是城市用水井中第2種常被檢出的物質(zhì)[1]．基于MTBE的污染及其對人體潛在的致癌可能性，歐美等發(fā)達國家從2000年開始，逐漸限制和停止MTBE的使用，并對其造成的環(huán)境污染開展了大量的治理研究工作．目前MTBE的降解處理主要有3種方法：高級氧化技術(shù)、植物修復(fù)和微生物降解．高級氧化技術(shù)[2]由于需消耗大量化學(xué)氧化劑和對反應(yīng)器設(shè)計要求高等特點，在用于被MTBE大面積污染的水環(huán)境治理時并不理想；植物培養(yǎng)周期長、培養(yǎng)條件苛刻以及植物根須觸及的范圍有限等缺點，限制了植物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用前景[3]；近年來隨著MTBE降解菌株的發(fā)現(xiàn)，MTBE的微生物降解技術(shù)備受關(guān)注[4-5]．然而由于 MTBE的碳鏈較短且存在一個叔丁基碳，同時存在一個烷基醚鍵，位阻較大，使得迄今發(fā)現(xiàn)的可利用 MTBE為唯一碳源的微生物生長緩慢，其生長速率一般在0.03 mg cells/d以下；同時降解菌的細胞得率也很低，多小于0.43 mg cells/mg MTBE[6]，從而造成 MTBE的生物降解速率比一般有機物的降解要慢很多，降解周期幾十天甚至上百天的都有過報道[7-8]；且根據(jù)環(huán)境條件的不同，MTBE的最終降解率差別很大[9-10]．研究發(fā)現(xiàn)，有 MTBE污染的地方常伴隨有其他污染物存在(稱為共存基質(zhì))，某種程度上共存基質(zhì)的存在可能會促進或抑制微生物對目標(biāo)污染物的降解．Liu等[11]用丁烷氧化菌 Arthrobacter對MTBE污染進行治理時發(fā)現(xiàn)，丁烷和乙炔的存在會對該菌降解 MTBE產(chǎn)生負面影響；Hanson等[12]的研究表明，單菌Hydrogenophaga flava ENV735在有少量酵母膏加入時，可顯著促進 MTBE的降解，而氫氣、氨基酸、維他命、甲醛、CO、烯炳基硫脲或乙炔等對其降解MTBE則不存在任何影響．

在 MTBE污染環(huán)境的修復(fù)治理時，現(xiàn)場環(huán)境中好氧微生物的多少對 MTBE生物降解效果具有重要作用．若土著微生物不適宜污染物的生物降解，或活性不高，則需要通過接種外來優(yōu)勢菌的方法達到修復(fù)治理目的．優(yōu)勢菌一方面要經(jīng)受當(dāng)?shù)丨h(huán)境的考驗，另一方面與土著微生物還存在競爭，因此研究優(yōu)勢菌降解目標(biāo)污染物的最適宜條件，以便通過工程措施迅速啟動生物降解過程，強化生物修復(fù)效果顯得尤為重要．筆者從長期受石油污染的土著微生物中分離篩選出降解 MTBE的優(yōu)勢菌株，并通過其形態(tài)特征和16S rDNA測序的方法進行鑒定；同時考察MTBE降解過程中溶解氧(dissolved oxygen，DO)變化和優(yōu)勢菌株的生長情況，以及通過提高系統(tǒng)的初始溶解氧含量，尤其通過添加常與 MTBE同時出現(xiàn)的其它含碳基質(zhì)等方法，研究生物強化技術(shù)對優(yōu)勢菌株降解MTBE的影響，以期為遭受 MTBE污染環(huán)境的修復(fù)提供一定的理論依據(jù)和應(yīng)用參考．

1 材料與方法

1.1 菌種富集馴化、分離純化及鑒定

實驗中所用微生物取自天津大港油田長期被石油污染的土壤．將 200,g土壤置于 MTBE初始質(zhì)量濃度約為 50,mg/L的 2 L無機鹽培養(yǎng)基中[13]，于30,℃條件下曝氣富集馴化培養(yǎng)，每天換一次培養(yǎng)基并補充MTBE；15,d后加大MTBE質(zhì)量濃度，每天遞增 10,mg/L，30,d后經(jīng)馴化的土著微生物則以 MTBE為唯一碳源；再經(jīng) 30,d的穩(wěn)定培養(yǎng)，取菌液接到無機鹽固體培養(yǎng)基的平板上，72,h后所得菌落可用于優(yōu)勢菌株的分離純化．

16S,rDNA擴增及序列測定：從長有優(yōu)勢菌株菌落的斜面上用滅菌牙簽挑取部分置于裝有 10,μL無菌水(16S-free H2O)的離心管中，99,℃熱變性 10,min后進行離心分離，然后取 5～10,μL上清液作模板進行PCR反應(yīng)．PCR反應(yīng)體系的試劑及用量如表1所示．正向引物(Seq Forward)為：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’；反向引物(Seq Reverse)為：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’．PCR 反應(yīng)條件為：94,℃預(yù)變性 5,min，94,℃變性 1,min，50～55,℃退火 1,min，72,℃延伸 1.5,min，30 個循環(huán)，72,℃保溫 5,min．使用切膠回收試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0，Code No.DV805A)回收純化 PCR擴增產(chǎn)物，從其上取 1.5,kbp左右的PCR擴增片斷，并委托寶生物工程(大連)有限公司進行 DNA測序，測序結(jié)果用 BLAST軟件與 GenBank中的16S,rDNA序列進行同源性比較．

表1 PCR試劑用量Tab.1 Mass of PCR reagent

1.2 生物強化對MTBE降解的影響

(1) MTBE降解過程中DO和菌的濃度(OD600)的變化．在250,mL可密閉的血漿瓶中加入MTBE初始質(zhì)量濃度約為60,mg/L的無機鹽液體培養(yǎng)基(pH＝7.0)，按 20%的接種量接入優(yōu)勢菌株(OD600為 0.65)，液相總體積控制為 100,mL．在溫度為 30,℃，轉(zhuǎn)速為150,r/min的搖床內(nèi)進行培養(yǎng)[14]．平行樣共9個，從第2,天每隔1,d取一試樣按序分析DO和OD600值．

(2) DO對MTBE的強化降解影響．接種20%的優(yōu)勢菌株于無機鹽液體培養(yǎng)基(pH＝7.0)中，通過向液體注入氮氣、空氣或氧氣以控制不同的初始 DO值，再加入定量的 MTBE，使其初始質(zhì)量濃度約為60,mg/L，并保持液相總體積為 100,mL．然后在恒溫恒轉(zhuǎn)速的搖床中進行培養(yǎng)(30,℃，150,r/min)，期間分別測定 MTBE隨時間的變化，14,d后對比各自的降解情況．

(3) 共存基質(zhì)對 MTBE降解的影響．接種 20%的優(yōu)勢菌株于MTBE初始質(zhì)量濃度約為60,mg/L的無機鹽液體培養(yǎng)基(pH＝7.0)中，同時在平行樣中分別加入苯、甲苯和乙醇，使其初始質(zhì)量濃度均為50,mg/L左右，并控制液相總體積為 100,mL．在溫度為 30,℃，轉(zhuǎn)速為 150,r/min的搖床內(nèi)進行培養(yǎng)，之后每隔 1,d取樣分析，14,d后對比各自的降解情況．其中，各個反應(yīng)體系的初始DO值約為7.10．

1.3 分析方法

MTBE、苯、甲苯和乙醇濃度的測定采用氣相色譜峰面積外標(biāo)法定量，色譜儀為美國 PE公司AutoSystem XL型．色譜條件：FFAP毛細柱(15,m×0.32,mm×,0.25μm)，柱溫 105,℃；FID 檢測器，溫度 300,℃；進樣口溫度 200,℃，進樣量 1,μL．載氣流量(N2)0.50,mL/min；氫氣流量 45,mL/min；空氣流量 300,mL/min；分流比 10∶1；衰減 l．

溶液 DO含量采用美國哈希公司的 sensIONTM6型便攜式溶解氧測定儀進行測定．

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢菌株的形態(tài)特征及16S,rDNA分析結(jié)果

經(jīng)過分離純化后篩選得到一株能以 MTBE為唯一碳源和能源的優(yōu)勢菌株．菌株在無機鹽固體培養(yǎng)基平板上生長時，菌落直徑為 3～4,mm，圓形，低突起，邊緣整齊，表面光滑，有光澤，呈灰白色，見圖l(a)；細胞粗短桿狀，(0.6～0.8)μm ×(1.2～1.6)μm，單獨、成雙或短鏈狀排列，革蘭氏陰性，見圖 l(b)；氧化酶為陰性．經(jīng)過測定，獲得菌株的 16S,rDNA序列與 GenBank中已登錄產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca，AJ871856)的同源性高達 99%，結(jié)合菌株的形態(tài)和部分生理生化特征，初步鑒定為 Klebsiella oxytoca．

2.2 生物強化對MTBE降解的影響

2.2.1 MTBE降解過程中DO和OD600的變化

圖1 優(yōu)勢菌株的形態(tài)Fig.1 Optical microscope of strain

對于好氧生物降解，溶解氧和菌體濃度的變化能夠在一定程度上反映有機污染物的去除效果和進程．由圖 2可以看出，本文篩選出的優(yōu)勢菌株在降解MTBE過程中，菌的濃度是先增大而后下降直至 8,d后趨于緩慢增長，同時DO伴隨OD600的增大呈明顯下降趨勢；當(dāng)OD600趨于緩慢增長時，DO的下降也趨于平緩．分析認為，開始階段實驗體系中 DO充足，優(yōu)勢菌株處在對數(shù)生長期，具有較快的生長速度；同時由于MTBE發(fā)生了好氧生物降解，DO因被大量消耗而迅速下降，使得優(yōu)勢菌株對基質(zhì)和DO的利用產(chǎn)生競爭，造成部分菌體死亡，OD600下降；當(dāng)存活菌株對基質(zhì)和DO的競爭利用程度逐漸趨于平衡時，系統(tǒng)處于正常的代謝和降解狀態(tài)，表現(xiàn)為 OD600緩慢增長，DO緩慢下降．因此可以設(shè)想，若能通過某些工程技術(shù)措施保證系統(tǒng)初始DO值較大，且始終維持在一個較高狀態(tài)時，就能消除溶解氧對優(yōu)勢菌株的限制，從而促進MTBE的生物去除效果．

圖2 MTBE降解過程中DO和OD600的變化Fig.2 Variation of DO and OD600 during MTBE degradation

2.2.2 DO對MTBE的強化降解影響

研究表明，微生物在 MTBE污染環(huán)境的生長和代謝過程中，氧的作用都是積極的，甚至是必不可少的，而且 DO的大小會直接影響生物修復(fù)的效果[15-16]．不同初始DO值下，溶解氧對MTBE的強化生物降解情況如圖 3所示．結(jié)果表明，優(yōu)勢菌株對MTBE的生物去除率隨初始 DO值的升高而增大．當(dāng)初始DO值低于3.2時，菌株對MTBE的降解去除率低于 20%；而當(dāng)初始 DO值高于 7.4時，去除率就可以達到 50%以上．因此可以斷定，在對遭受MTBE污染的環(huán)境進行生物修復(fù)，尤其是對污染地下水進行原位修復(fù)時，考慮到地下水環(huán)境中的有限氧含量，更應(yīng)通過技術(shù)手段[17]來提高地下水系統(tǒng)中的 DO含量或控制DO不低于某個值，才能對本文篩選出的優(yōu)勢菌株降解MTBE起到一定的強化作用．

圖3 初始DO對MTBE降解的影響Fig.3 Effect of initial dissolved oxygen concentration on,MTBE degradation

2.2.3 共存基質(zhì)對MTBE降解的影響

一般污染環(huán)境中的污染物組分比較復(fù)雜，與MTBE相伴的常見有芳香烴或醇類等物質(zhì)．這些物質(zhì)的存在可能會對 MTBE的生物降解產(chǎn)生促進或抑制作用．因此可以考慮對 MTBE污染的環(huán)境進行共存基質(zhì)的調(diào)整，以達到強化微生物的降解效果．文中以苯、甲苯和乙醇為例，對優(yōu)勢菌株在上述有機物共存時降解 MTBE的情況進行了研究，其影響結(jié)果如圖4所示．當(dāng)MTBE與苯或甲苯共存時，優(yōu)勢菌株對MTBE的降解相對于 MTBE單獨存在時(MTBE去除率為 50.0%)明顯減慢，14,d后的去除率僅分別為37.1%和43.1%，苯對MTBE的抑制作用要強于甲苯；而當(dāng) MTBE與乙醇共存時，菌株對 MTBE的生物去除效果增強，14,d后的去除率可達63.3%．分析認為，苯、甲苯和乙醇的存在都會對優(yōu)勢菌株去除 MTBE產(chǎn)生競爭，其代謝機理可能是微生物通過降解易降解的乙醇，產(chǎn)生大量生物所需的能量，增強了關(guān)鍵酶活性，提高了生物氧化率，使得微生物的活性得到增強；而對于苯和甲苯，微生物雖然能降解一定量的該化合物，但其本身或是其降解中間產(chǎn)物可能對菌株的毒性更大，或是產(chǎn)生競爭性抑制[8]，限制了微生物對MTBE的生物降解．

針對乙醇對優(yōu)勢菌株降解 MTBE具有一定的促進作用，通過改變共存乙醇的初始濃度，在與上述實驗條件相同情況下，進一步考察了乙醇對降解MTBE的影響，其結(jié)果如圖 5所示．結(jié)果表明，當(dāng)與 MTBE共存的乙醇質(zhì)量濃度不高于 200,mg/L時，就會對菌株降解 MTBE產(chǎn)生促進作用；但隨乙醇濃度的進一步增大，促進作用逐漸減弱．造成此現(xiàn)象的原因可能是乙醇濃度較高時，菌株會優(yōu)先以乙醇作為生長和代謝的底物，造成電子受體的過多消耗，進而在一定程度上抑制了微生物對MTBE的利用．

圖4 共存基質(zhì)對MTBE降解的影響Fig.4 Effect of coexisting organic compounds on MTBE,degradation

圖5 乙醇初始質(zhì)量濃度對MTBE強化降解的影響Fig.5 Effect of initial ethanol concentration on MTBE bioaugmented degradation

3 結(jié) 語

通過對取自天津大港油田的土著菌培養(yǎng)馴化，分離篩選得到的優(yōu)勢菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)特征和 16S,rDNA測序鑒定，結(jié)果為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)．采用生物強化措施，提高降解體系中的溶解氧含量可明顯改善 MTBE的去除效果；苯和甲苯的存在對Klebsiella oxytoca生物降解MTBE均產(chǎn)生負面影響，苯對 MTBE的抑制作用要強于甲苯；適量的乙醇共存可在一定程度上強化優(yōu)勢菌株對 MTBE的生物降解，實驗期間內(nèi) MTBE的去除率達到63.3%，上述結(jié)果可為遭受 MTBE污染環(huán)境的生物強化修復(fù)技術(shù)應(yīng)用提供一定的參考．

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