毛苕子綠汁發(fā)酵液發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

吳進東

隨著農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，畜牧業(yè)在農(nóng)村蓬勃發(fā)展起來，作為冬春季青綠飼料的青貯飼料調(diào)制越來越受重視。但由于農(nóng)民缺少青貯調(diào)制技術(shù),加之農(nóng)村的很多青貯原料為豆科飼草和農(nóng)作物秸稈,水溶性碳水化合物含量少、緩沖能較高,乳酸菌數(shù)量少,采用常規(guī)青貯技術(shù)很難調(diào)制優(yōu)質(zhì)青貯飼料[1-2]。綠汁發(fā)酵液(Previously Fermented Juice，PFJ)是近年研制出的一種青貯添加劑。它的最大特點是經(jīng)濟環(huán)保，制作工藝流程簡單、生產(chǎn)成本低,青貯效果顯著,易于推廣[3-5]。研究表明:不同的條件下制作的PFJ效果可能不同,使其應(yīng)用受到限制。但如何提高改善PFJ的發(fā)酵品質(zhì),以提高其添加應(yīng)用效果的研究報道很少。為了更有效地利用PFJ,試驗通過在毛苕子(Vicia villosa Roth.)青貯原料中添加不同條件下制作的PFJ,研究其對毛苕子青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，優(yōu)化出PFJ發(fā)酵條件(水草比例、葡萄糖添加劑、氯化鈉添加劑)的適宜模式,從而充分利用農(nóng)村豐富的飼料作物,擴大青貯原料來源,提高青貯飼料品質(zhì),為畜牧業(yè)的發(fā)展、農(nóng)民的增收做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用毛苕子為第一茬初花期，收割時含水量較高，收后晾曬2 h，使水分減少到75%左右，再進行青貯。青貯原料清潔新鮮、無泥土夾雜，剔除過于枯老以及霉變的部分。青貯原料各組成的營養(yǎng)成分見表1。

表1 毛苕子青貯原料的營養(yǎng)成分（%）

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用L9(34)正交表設(shè)計三因素三水平三重復(fù)的正交試驗，綠汁發(fā)酵液發(fā)酵條件模式試驗因素水平見表2。將毛苕子切碎至1 cm放入榨汁機，加入相應(yīng)重量蒸餾水，粉碎榨汁后浸泡30 min，用雙層紗布過濾至容器中。水草比例指新鮮毛苕子和所加蒸餾水的質(zhì)量比，按試驗設(shè)計加入不同比例的葡萄糖、氯化鈉，比例為葡萄糖、氯化鈉和綠汁發(fā)酵液質(zhì)量之比，搖勻，分別裝入玻璃瓶，添加食用白米醋調(diào)節(jié)pH值至4.2,密封，于30℃避光發(fā)酵48 h。2007年4月28日，將毛苕子用鐮刀收割，用鍘刀切成理論長度為1 cm的短段，均勻加入不同綠汁發(fā)酵液進行青貯試驗。裝入塑料食品袋內(nèi)，每袋約1 000 g，抽真空，密封，每個青貯處理作3袋，共27袋。貯藏60 d。

表2 綠汁發(fā)酵液發(fā)酵條件模式的優(yōu)化研究試驗

1.3 測定項目與方法

1.3.1 實驗室評定

綠汁發(fā)酵液中的乳酸菌數(shù)：采用MRS培養(yǎng)基，平板涂布，30℃有氧培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落形成單位(Colony Forming-Unit，CFU)，并計算乳酸菌菌落形成單位的對數(shù)(lgCFU)[6]。

青貯料指標：取青貯料樣品20 g，加入180 ml蒸餾水，攪拌均勻，靜置24 h，用PHS-3C酸度計測定青貯料浸出液的pH值[7]；乳酸(LA)含量測定是用鎢酸、硫酸銅和氫氧化鈣處理后，用比色法測定乳酸含量[8]；用SQ206氣相色譜儀測定浸出液的揮發(fā)性脂肪酸（VFA）、乙酸(AA)、丁酸(BA)的含量[9]，并用弗氏(Fleig)評分法評分[10]；氨態(tài)氮(NH3-N)和粗蛋白質(zhì)(CP)的含量用凱氏定氮法測定。

1.3.2 青貯料感官鑒定

青貯飼料感官評定標準參照我國1996年農(nóng)業(yè)部下發(fā)的《青貯飼料質(zhì)量評定標準》[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS12.0和正交設(shè)計助手統(tǒng)計軟件進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗室鑒定（見表3）

2.1.1 不同處理對綠汁發(fā)酵液中的乳酸菌數(shù)影響

青貯效果的好壞與作為青貯添加劑的綠汁發(fā)酵液本身乳酸菌數(shù)量有著密切的關(guān)系。試驗中乳酸菌數(shù)量以乳酸菌菌落形成單位的對數(shù)(lgCFU)表示。由表3的lgCFU值進行極差分析，算出各因素的極差得：RA、RB、RC分別為 0.02、0.63、0.36，而空列極差 RD為 0.07。得：A、B、C三因素及用于估計誤差的空列D對lgCFU值的影響大小為B＞C＞D＞A。將A因素影響歸于誤差項進行方差分析得：因素B內(nèi)不同水平間lgCFU值差異極顯著(F=214.29＞F2,4,0.01=18.00，P＜0.01)，多重比較各水平平均數(shù)B3、B2差異不顯著，二者均顯著大于B1；因素C內(nèi)不同水平間lgCFU值差異極顯著（F=69.43＞F2,4,0.01=18.00，P＜0.01），其各水平平均數(shù) C1、C3差異不顯著，二者均小于C2；而因素A內(nèi)不同水平間lgCFU值差異不顯著（P＞0.05）；直觀看，試驗各處理中以A1B2C2、A3B3C2為優(yōu)；綜合評價最優(yōu)綠汁發(fā)酵液發(fā)酵模式應(yīng)為 A1－3B2－3C2。

2.1.2 添加不同處理綠汁發(fā)酵液對青貯飼料pH值的影響

青貯飼料pH值的高低反映其發(fā)酵品質(zhì)，優(yōu)良青貯飼料的pH值應(yīng)在4.2以下。由表3的pH值可以直觀發(fā)現(xiàn),除處理7的pH值在4.2以上,其它處理的pH值都在4.2以下,達到優(yōu)良標準。進一步對pH值進行極差分析,算出各因素的極差得:RA、RB、RC分別為0.02、0.35、0.22, 而空列極差 RD為 0.03。 得:A、B、C 三因素及用于估計誤差的空列D對pH值的影響大小為B＞C＞D＞A。將A因素影響歸于誤差項進行方差分析得：各因素對pH值的影響與2.11節(jié)中對乳酸菌數(shù)影響密切相關(guān)。因素B內(nèi)不同水平間pH值差異極顯著(F=151.33＞F2,4,0.01=18.00,P＜0.01),多重比較各水平平均數(shù)B3、B2差異不顯著,二者均顯著小于B1;因素C內(nèi)不同水平間pH值差異極顯著 (F=54.00＞F2,4,0.01=18.00,P＜0.01),其各水平平均數(shù)C1、C3差異不顯著，二者均顯著大于C2;而因素A內(nèi)不同水平間pH值差異不顯著(P＞0.05);直觀看,試驗各處理中也以 A1B2C2、A3B3C2為優(yōu);綜合評價最優(yōu)綠汁發(fā)酵液發(fā)酵模式應(yīng)為A1-3B2-3C2。

表3 L9(34)正交表和綠汁發(fā)酵液及青貯料的正交試驗結(jié)果

2.1.3 添加不同處理綠汁發(fā)酵液對青貯飼料有機酸含量的影響

在各種有機酸中，乳酸、乙酸和丁酸含量是衡量青貯飼料品質(zhì)的三個重要指標。乳酸是由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生，一般來說乳酸含量越高青貯品質(zhì)越好。乙酸是一種揮發(fā)性有機酸，是大腸桿菌等發(fā)酵糖分的主要產(chǎn)物，主要產(chǎn)生在發(fā)酵初期。丁酸，也是一種揮發(fā)性有機酸,具有難聞的氣味,使青貯料發(fā)臭,降低營養(yǎng)價值，一般在青貯后期由酪酸菌發(fā)酵產(chǎn)生,發(fā)生丁酸發(fā)酵的飼料，青貯品質(zhì)較差。有機酸構(gòu)成可以反映青貯發(fā)酵過程的好壞。該指標可以采用世界通用的修訂后的弗氏評分法進行評分。由表3的弗氏評分可以直觀算出各因素的極差得：RA、RB、RC分別為 1.00、11.00、5.67,而空列極差RD為0.34。通過極差分析得：A、B、C三因素及用于估計誤差的空列D對弗氏評分的影響大小為B＞C＞A＞D,因此,不能將A因素影響歸于誤差項,以空列D估計誤差進行方差分析得:因素A內(nèi)不同水平間弗氏評分差異不顯著(F=7.01＜F2,2,0.05=19.00，P＞0.05);而因素B內(nèi)不同水平間弗氏評分差異極顯著 (F=950.00＞F2,2,0.01=39.00,P＜0.01),多重比較各水平平均數(shù)B3、B2差異不顯著,二者均顯著大于B1;因素C內(nèi)不同水平間弗氏評分差異極顯著 (F=259.26＞F2,2,0.01=39.00,P＜0.01),其各水平平均數(shù)C1、C3差異不顯著，二者均顯著小于C2。直觀看，試驗各處理中也以A1B2C2、A3B3C2為優(yōu)；綜合評價最優(yōu)綠汁發(fā)酵液發(fā)酵模式應(yīng)為A1-3B2-3C2。同時由表4得：各處理的丁酸占總酸比值差異不顯著；而乳酸占總酸比值和乙酸占總酸比值差異顯著。

2.1.4 添加不同處理綠汁發(fā)酵液對青貯飼料氨態(tài)氮/總氮（NH3-N/TN）的影響

氨態(tài)氮與總氮的質(zhì)量比，反映了青貯飼料中蛋白質(zhì)和氨基酸分解的程度，因為正常青貯料中蛋白質(zhì)只分解至氨基酸，氨存在則表示有腐敗現(xiàn)象，該值越大說明蛋白質(zhì)和氨基酸分解越多，意味著青貯飼料品質(zhì)不佳[10]。由表3的NH3-N/TN可以直觀對其進行極差分析，算出各因素的極差得：RA、RB、RC分別為 0.80、7.00、3.97，而空列極差 RD為 1.17。 得：A、B、C 三因素及用于估計誤差的空列D對氨態(tài)氮/總氮的影響大小為B＞C＞D＞A。將A因素影響歸于誤差項進行方差分析得:因素B內(nèi)不同水平間氨態(tài)氮/總氮差異極顯著(F=52.35＞F2,4,0.01=18.00,P＜0.01),多重比較各水平平均數(shù)B3、B2差異不顯著,二者均顯著小于B1;因素C內(nèi)不同水平間氨態(tài)氮/總氮差異顯著 (F=17.27＞F2,4,0.05=6.49,P＜0.05)，其各水平平均數(shù)C1、C3差異不顯著,二者均顯著大于C2;而因素A內(nèi)不同水平間pH值差異不顯著(P＞0.05);優(yōu)化所得綠汁發(fā)酵液發(fā)酵模式為A1-3B1-3C2。

2.2 青貯料的感官鑒定結(jié)果

感官評定參照我國1996年農(nóng)業(yè)部下發(fā)的 《青貯飼料質(zhì)量評定標準》，綜合青貯飼料嗅覺、結(jié)構(gòu)、色澤三項得分給出評定結(jié)果見表4。除了處理A3B1C3為“中等”等級，其它各處理均為“優(yōu)良”等級。綜合分析，各添加劑處理均顯著提高了青貯飼料品質(zhì)，和實驗室評定結(jié)論基本一致。

表4 正交試驗感官鑒定及有機酸質(zhì)量分數(shù)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 試驗表明：葡萄糖、氯化鈉添加量對毛苕子綠汁發(fā)酵液的乳酸菌含量、青貯飼料的pH值、弗氏評分、氨態(tài)氮的影響顯著；葡萄糖最佳添加量為2%或5%；氯化鈉最佳添加量為0.5%。水草比例對上述指標影響不顯著。理論上可以認為：毛苕子綠汁發(fā)酵液的適宜發(fā)酵條件模式為2：1或5：1或10：1的水草比例+2%或5%的葡萄糖添加量+0.5%的氯化鈉添加量；考慮到生產(chǎn)的實用性，推薦在生產(chǎn)中使用的優(yōu)化模式為10：1的水草比例+2%的葡萄糖添加量+0.5%的氯化鈉添加量。這說明稀釋2～10倍綠汁發(fā)酵液均可為發(fā)酵過程提供有效活菌種，促進發(fā)酵，在生產(chǎn)中能夠一樣發(fā)揮其促進乳酸發(fā)酵，顯著改善青貯發(fā)酵品質(zhì)的作用；添加2%葡萄糖就可以促進綠汁發(fā)酵液發(fā)酵，抑制了有害微生物對蛋白質(zhì)的分解作用，提高了毛苕子綠汁發(fā)酵液的效果；添加適量氯化鈉(0.5%)可以抑制有害微生物，提高發(fā)酵品質(zhì)，但是高的氯化鈉（1%）添加量對有害細菌的抑制同時也對乳酸菌菌系抑制，導致乳酸產(chǎn)生減少，pH值終值較高，有害微生物受到的抑制作用有限，導致綠汁發(fā)酵液中的乳酸菌含量減少，而氨態(tài)氮含量增多。

3.2 試驗只選擇了3個綠汁發(fā)酵液發(fā)酵條件，水平只設(shè)3個，無法準確建立各指標和綠汁發(fā)酵液發(fā)酵條件模式之間的更精確的關(guān)系。如要得到更精確的最適綠汁發(fā)酵液發(fā)酵條件則需增加試驗因素和水平。另外如有可能，應(yīng)延長試驗時間再結(jié)合動物試驗來綜合評判青貯飼料的適口性、消化率等指標，以使評定結(jié)果更為客觀準確，為今后農(nóng)作物青貯技術(shù)提供科學依據(jù)。

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