一株耐高溫?zé)o機(jī)磷降解菌解磷能力的研究

胡春明，姚 波，席北斗，魏自民，趙 越*，胡德勝

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院水環(huán)境系統(tǒng)工程研究室，北京 100012；3.北京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100876；4.哈爾濱工程大學(xué)水聲工程學(xué)院，哈爾濱 150001）

在農(nóng)業(yè)種植方面，磷是植物必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，大多數(shù)耕地土壤中磷素的95%與Fe、Ca和Al等結(jié)合成無(wú)效態(tài)磷，植物難以直接吸收利用，導(dǎo)致全國(guó)有74%的耕地土壤缺磷[1]。我國(guó)的農(nóng)用磷肥主要是磷礦粉經(jīng)加工而成[2]，但其中也有相當(dāng)一部分為無(wú)效態(tài)磷，如直接施用，肥效受許多因素限制[3-4]。而解磷微生物可以通過(guò)活化難溶磷促進(jìn)植物生長(zhǎng)[5]。近年來(lái)的堆肥試驗(yàn)表明，在添加難溶性磷礦粉的堆肥中接種適合堆肥環(huán)境的耐高溫解磷微生物，能夠加快堆料中難溶性磷的轉(zhuǎn)化，獲得富磷生物有機(jī)肥[6-7]。因此，為提高堆肥中難溶性無(wú)機(jī)磷的轉(zhuǎn)化效率，篩選、馴化適合于堆肥環(huán)境的高溫?zé)o機(jī)磷降解微生物逐漸引起研究者的重視[8-9]。隨著對(duì)解磷微生物研究的深入，有較多的解磷菌被報(bào)道，但大多是一些常溫菌，不適合于堆肥復(fù)雜的高溫環(huán)境。本研究采用課題組從高溫堆肥樣品中篩選得到的1株耐高溫?zé)o機(jī)磷降解菌株，結(jié)合不同因素水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，闡明各因素水平對(duì)其解磷能力的影響，進(jìn)而為其在實(shí)際堆肥中的應(yīng)用與推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

高溫?zé)o機(jī)磷降解菌：霉菌，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。耐受溫度范圍廣（35～50℃），解磷能力強(qiáng)。

1.1.2 磷礦粉

磷礦粉：總磷16.56%；速效磷（檸檬酸-P）3.55%；水溶性磷0.25%，取自貴州某磷礦廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基

用于對(duì)菌種活化，難溶性磷礦粉為其中唯一磷源。葡萄糖 10 g，（NH4）2SO40.5 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，磷礦粉5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，瓊脂粉 18 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖 10 g ，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，KH2PO45 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖 10 g ，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，磷礦粉添加量見(jiàn)表1，分別按4、5、6、7 g·L-1的水平數(shù)進(jìn)行，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)軟件（正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1），將發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)間、磷礦粉添加量及菌劑接種量作為優(yōu)化因素，選定L16（45）正交表，并安排一個(gè)空列填充因素?cái)?shù)。

1.2.2 菌株的活化

將供試菌株用無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基進(jìn)行斜面劃線，按表1中相應(yīng)的溫度水平在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，活化菌種。

表1 正交設(shè)計(jì)因素及水平Table1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.3 種子液制備

將1.2.2中活化好斜面保藏的解磷菌株，接種于種子培養(yǎng)基中，解磷菌按表1中相應(yīng)的溫度水平，120 r·min-1，搖床培養(yǎng) 72 h，菌種量 108cfu·mL-1，備用。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)處理

將種子液按表1中的接種量水平接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，120 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間和溫度均按照表1中的水平進(jìn)行，并以接滅活菌為對(duì)照組，對(duì)可溶性磷及微生物量磷等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析測(cè)定，同時(shí)制作相應(yīng)的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 解磷量的測(cè)定

可溶性磷的測(cè)定：將發(fā)酵培養(yǎng)基于5 000 r·min-1離心10 min，取上清夜，鉬銻鈧比色法測(cè)定可溶性磷含量[10]。

微生物量磷的測(cè)定：將上述離心后所得的菌種，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗、離心，洗去菌種表面粘附的發(fā)酵液，121℃滅活30 min，加6%的H2O25 mL，60℃水浴48 h以破壞菌體，釋放出微生物量磷，離心取上清液，釩鉬黃比色法測(cè)定微生物量磷[10]。根據(jù)如下公式計(jì)算解磷總量和無(wú)機(jī)磷降解率。

解磷總量（μg·mL-1）=可溶性磷量+微生物量磷

微生物解磷率（%）=[（接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中解磷總量-接滅活菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的對(duì)照組中的解磷總量）/添加的磷礦粉中的總磷量]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷總量的變化

2.1.1 解磷總量的直觀分析

結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)發(fā)酵液中磷礦粉添加量為7.0 g·L-1、高溫?zé)o機(jī)磷降解菌的接種量5 mL·L-1時(shí)，在45℃下培養(yǎng)22 d后，發(fā)酵液中解磷總量達(dá)到最大327.60 μg·mL-1。由于該組數(shù)據(jù)中磷礦粉的添加量為最大比例，而菌劑接種量則為最小比例，說(shuō)明在本研究的接種范圍內(nèi)，解磷量與解無(wú)機(jī)磷微生物的接種量沒(méi)有明顯的相關(guān)性。同時(shí)，在16組試驗(yàn)數(shù)據(jù)之中，培養(yǎng)時(shí)間為22 d的條件下，其解磷總量都相對(duì)較大。

由表2可知，時(shí)間的極差值為156.607，對(duì)發(fā)酵液中解磷總量的影響最大，在磷成為微生物生長(zhǎng)繁殖的限制因素時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間的增加，微生物的解磷時(shí)間增加，結(jié)果也使得發(fā)酵液中總磷含量增加。溫度的極差值最?。?0.167），這是由于該菌株的耐熱性范圍較廣，在35～50℃溫度范圍均具有較高的活性。發(fā)酵液中磷礦粉添加量的極差值也相對(duì)較小，這說(shuō)明選擇4、5、6、7 g·L-1這個(gè)范圍的量添加磷礦粉，對(duì)解磷微生物的解磷能力影響不大。研究表明，在磷礦粉添加量達(dá)到15 g·L-1的情況下，會(huì)嚴(yán)重影響解磷菌的解磷環(huán)境，使得解磷能力嚴(yán)重降低。

表2 解磷總量的正交設(shè)計(jì)軟件分析Table2 Analysis of total soluble phosphorus by orthogonal design software

2.1.2 解磷總量的方差分析

圖1為經(jīng)正交設(shè)計(jì)軟件分析出的F值，培養(yǎng)溫度的方差最?。?.019），主要是因?yàn)樵摼臏囟饶褪芊秶^廣，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度范圍內(nèi)（35～50℃）均具有很好的解磷能力；圖1中僅時(shí)間的F值（4.534）大于臨界值3.29，這與極差分析中時(shí)間對(duì)解磷量的影響最大相一致，同時(shí)說(shuō)明該株菌的解磷總量在本研究限定的較窄的范圍內(nèi)與溫度、添加磷礦粉的量及接種量等因素相關(guān)性不顯著。

2.2 微生物解磷率變化

2.2.1 微生物解磷率的直觀分析

本試驗(yàn)供試菌株，在培養(yǎng)基中磷礦粉添加量、菌劑接種量分別為4 g·L-1和11 mL·L-1，50℃下培養(yǎng)22 d后，微生物的解磷率最大（37.55%），該組試驗(yàn)中菌劑接種量最大。其次是培養(yǎng)條件為：磷礦粉添加量4 g·L-1，在接種9 mL·L-1的解磷菌后，于45℃下培養(yǎng)17 d后，無(wú)機(jī)磷的降解率達(dá)34.47%，解磷率也比較高。

正交軟件對(duì)微生物解磷率的分析結(jié)果見(jiàn)表3。時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中微生物解磷率的影響最大，極差達(dá)17.412，這與發(fā)酵液中解磷總量分析相一致，培養(yǎng)時(shí)間的增加，使得解磷微生物對(duì)磷礦粉中的無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化時(shí)間增加，最終增加了解磷率。發(fā)酵液中菌劑接種量的極差最小（1.855），這是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中，解磷微生物能夠利用環(huán)境條件和自身的解磷能力迅速繁殖，說(shuō)明菌劑接種量不是無(wú)機(jī)磷降解的限制因素。

表3 微生物解磷率的正交設(shè)計(jì)軟件分析Table3 Analysis of inorganic phosphorus-solubilizing ratio by orthogonal design software

2.2.2 磷礦粉降解率的方差分析

如圖2所示，時(shí)間的F值（3.55）大于臨界值3.29，說(shuō)明發(fā)酵液培養(yǎng)時(shí)間與微生物的解磷率呈顯著相關(guān)性，這與極差分析中時(shí)間對(duì)解磷總量的影響最大相一致；因素中添加磷礦粉的量、溫度及接種量的F值均小于F臨界值，相關(guān)性不顯著，說(shuō)明這些因素在本研究限定的范圍內(nèi)不是該菌株解磷量和解磷率的主要限制因素。

3 討論與結(jié)論

由于在堆肥的過(guò)程中，溫度變化范圍較廣，分別經(jīng)過(guò)升溫、高溫及降溫等過(guò)程。在堆肥周期內(nèi)，堆料的溫度一般均保持30℃以上，因此，接種微生物在不同溫度水平下是否具有活性是其在堆肥中成功應(yīng)用的關(guān)鍵因素。本試驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，在溫度為45℃培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)時(shí)間22 d、磷礦粉添加量 7.0 g·L-1、菌劑接種量為 5 mL·L-1，發(fā)酵液中解磷總量達(dá)到最大值（327.60 μg·mL-1）。不同因素水平條件下，溫度水平對(duì)試驗(yàn)選取的解無(wú)機(jī)磷菌的解磷量及解磷率極差均較小，在培養(yǎng)溫度35～50℃條件下，解無(wú)機(jī)磷微生物均具有較高的解磷能力。本研究解無(wú)機(jī)磷微生物對(duì)溫度的耐受范圍分析結(jié)果也為其在堆肥中應(yīng)用提供了依據(jù)，在實(shí)際接種堆肥過(guò)程中，除堆肥高溫期（>50℃）外，試驗(yàn)采用的解無(wú)機(jī)磷菌株能夠適應(yīng)堆肥過(guò)程中溫度變化，而堆肥的高溫期可以通過(guò)解無(wú)機(jī)磷微生物接種時(shí)間的控制加以避開(kāi)，進(jìn)而充分保持接種微生物的解磷活性。本試驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，培養(yǎng)時(shí)間是解無(wú)機(jī)磷微生物解磷量及解磷率的主要限制因素，說(shuō)明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，該解磷微生物可能通過(guò)自身的繁殖保持群落的穩(wěn)定性，進(jìn)而持續(xù)增加其對(duì)難溶性磷礦粉的解磷量及解磷率，培養(yǎng)時(shí)間22 d后難溶性磷礦粉的解磷量及解磷率可能會(huì)持續(xù)增加。但是，在一般情況下，采用反應(yīng)器堆肥周期大都低于20 d，因此本試驗(yàn)對(duì)于22 d后難溶性磷礦粉的解磷量及解磷率未作進(jìn)一步的研究。

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