黃曲霉毒素P1的高效液相色譜測(cè)定

涂文升

廣西腫瘤防治研究所藥劑科（530021）

黃曲霉毒素P1（AFTP1）是黃曲霉毒素B1（AFTB1）的代謝產(chǎn)物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：給恒河猴經(jīng)腹腔注射AFTB1，尿中主要代謝產(chǎn)物為葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，經(jīng)β葡萄糖醛酸水解后，經(jīng)鑒定主要為AFTP1，占恒河猴尿中黃曲霉毒素衍生物的60%[1]。為了進(jìn)一步研究AFTB1經(jīng)人體代謝后的產(chǎn)物AFTP1，特建立AFTP1的高效液相色譜測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀：包括LC-10AT泵、RF-530熒光檢測(cè)器、威瑪色譜數(shù)據(jù)工作站、CTO-10A柱溫箱等，上海安亭科學(xué)儀器廠TGL-16B型離心機(jī)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司XW-80型旋渦混合器。

甲醇為色譜純，三氟醋酸（進(jìn)口分裝）、乙醇、醋酸鉛均為國(guó)產(chǎn)分析醇，AFTP1對(duì)照品為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

2 色譜條件

分析柱：Shim-pack CLC-ODS C18（5.0mm×150mm，5μm），流動(dòng)相：無水乙醇，流速：0.75mL/min，柱溫：45℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：EX：365nm，EM：435nm，靈敏度：1。

3 方法與結(jié)果

3.1 AFTP1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取AFTP150μg，置于5.0mL的量瓶中，加入一定量的甲醇，在旋渦混合器上充分混合溶解后，加甲醇至刻度，即為10.0ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

3.2 樣品溶液的制備

取頭一天進(jìn)食過花生食品的健康人的尿液9.0mL，加入過飽和的醋酸鉛溶液1.0mL搖勻，用快速定性濾紙過濾，濾紙用少量氯仿洗滌，濾液轉(zhuǎn)移至25.0mL的比色管中，加入氯仿在旋渦混合器上提取3次（10.0、10.0、5.0mL），收集氯仿提取液，水浴揮干，殘?jiān)?.0mL無水乙醇溶液，轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，離心10min（15000r/min），上清液即為樣品溶液。

3.3 線性范圍的考察

取上述“3.1”的標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，以AFTP1的進(jìn)樣絕對(duì)量為縱坐標(biāo)（Y），AFTP1峰面積為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：137 177.4-11 3625.8Xr=0.9 996 線性范圍25～125ng。

3.4 精密度試驗(yàn)

取上述樣品溶液5.0μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，RSD=2.14%。

3.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密取經(jīng)測(cè)定不含AFTP1的尿液9.0mL，共5份，精確加入AFTP110.0μL，以下按“3.2樣品溶液加入過飽和的”后的步驟操作，進(jìn)樣5.0μL，RSD=1.85%。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品溶液在室溫、避光條件下放置，在上述色譜條件下于0、1、3、5d分別進(jìn)樣5.0μL。記錄峰面積，RSD=2.14%。結(jié)果表明在120h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密取經(jīng)測(cè)定不含AFTP1的正常人尿液9.0mL，共12份，分別精密加入上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液5.0、5.0、5.0、10.0、10.0、10.0、20.0、20.0、20.0μL，以下按“3.2樣品溶液加入過飽和的”后的步驟進(jìn)行，測(cè)定結(jié)果見表1。

圖1 色譜圖

表1 加樣回收結(jié)果（n=3）

3.8 尿樣測(cè)定

在上述選定的色譜條件下，取“3.2”樣品溶液5.0μL，測(cè)定其AFTP1含量（外標(biāo)法），測(cè)定結(jié)果，AFTP1 為129.80μg/L，色譜圖見圖1。

4 討 論

黃曲霉毒素的HPLC測(cè)定的報(bào)道較多，尤其是AFTB1及AFTM1，一般都是經(jīng)過三氟醋酸衍生化后再測(cè)定，這樣熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，有利于微量或痕量樣品的檢測(cè)[2,3]，而AFTP1的HPLC測(cè)定尚未見報(bào)道，本文經(jīng)過衍生化和沒有衍生化的對(duì)比處理測(cè)定，結(jié)果色譜的峰高和/或峰面積差異不大，而不經(jīng)過衍生化直接進(jìn)樣測(cè)定，更簡(jiǎn)單、快速，并且同樣能達(dá)到微量測(cè)定的要求。

AFTP1是AFTB1經(jīng)過體內(nèi)代謝后經(jīng)尿排出的一種代謝產(chǎn)物，所以進(jìn)行了尿中的回收率測(cè)定研究，同時(shí)還進(jìn)行了尿樣的測(cè)定，結(jié)果比較理想，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，為今后進(jìn)一步研究AFT高攝入地區(qū)居民尿中的AFTP1含量提供了實(shí)驗(yàn)參考和技術(shù)支持。

尿中各種代謝產(chǎn)物繁多，為了減少對(duì)色譜柱的污染，延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，同時(shí)也避免其對(duì)AFTP1測(cè)定主峰的干擾，在樣品的前處理時(shí)，加入10%的過飽和醋酸鉛溶液沉淀，過濾后再進(jìn)行AFTP1的提取，使其他干擾物質(zhì)減少到最低限度[4]。

[1]孟昭赫,張國(guó)柱,宋圃菊.真菌毒素研究進(jìn)展[M].北京：人民衛(wèi)生出版社出版,1979：108.

[2]涂文升,劉宗河,莫林華等.廣西肝癌高低發(fā)區(qū)兒童攝入黃曲霉毒素B1與尿中排出黃曲霉毒素M1的關(guān)系研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,1993,27(4)：218.

[3]涂文升,劉宗河,謝重華等.樹攝入黃曲霉毒素B1后尿中黃曲霉毒素M1排出水平的研究[J].廣西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1989,6(3)：59.

[4]Liu ZH,Tu WS,Li DR,et al. A New Methodfor the Quantitation of Aflatoxin M1Urine by High Performance Liquid Chromatography and Its Appliction to the Etiologic Study of Hepatoma[J]. Bio Chromatoghapy,1990,4(2)：83.