α2巨球蛋白與基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9在重癥急性胰腺炎中作用的研究

張穎毅 潘吉勇 宋永蔚 趙 華

1 遼寧省大連市第三人民醫(yī)院普通外科（116023）

2 遼寧省大連市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科（116023）

重癥胰腺炎約占急性胰腺炎的10%～15%，病情篤重，常合并較多嚴(yán)重的并發(fā)癥，病死率高達(dá)20%～30%[1]，仍是目前較為棘手的急腹癥之一。然而，目前SAP的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，對SAP的研究也是多方面、多角度的[2]。在SAP的發(fā)生發(fā)展中，由于各種炎性因子的刺激，炎癥細(xì)胞的過度表達(dá)，引起基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9（MMP-2，9）大量釋放[3-6]，進(jìn)一步刺激炎癥細(xì)胞的分化，并引起其抑制劑α2-巨球蛋白在血清中的動態(tài)平衡失衡[3]，增加SAP的死亡率。

人α2-M是一種大分子糖蛋白，α2-M的主要功能是結(jié)合、清除體內(nèi)蛋白水解酶，被認(rèn)為是體內(nèi)一種重要的防御蛋白[3]。Lohr等研究發(fā)現(xiàn)，AP病程中伴有ECM的分解，并與病情的嚴(yán)重性相關(guān)，因而其可作為預(yù)測結(jié)果的指標(biāo)，并間接證明MMP作為主要的基質(zhì)分解酶在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4，6]。如何阻止MMP-2，9的活性表達(dá)，減少SAP，隨著MMP-2，9及其抑制劑的深入研究，將成為SAP治療的新靶點。

本實驗?zāi)康脑谟谔接懄?-M與MMP-2，9在重癥急性胰腺炎（SAP）的相關(guān)機(jī)制并證實α2-M在SAP中的價值。降低胰腺出血壞死，炎細(xì)胞滲出率，從而避免繼發(fā)多臟器的損害，為臨床治療提供一個新途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

動物：健康普通級成年SD大鼠40只，體重180～200g（由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），雌雄不限。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和SAP大鼠動物模型的制備

將大鼠按隨機(jī)表法編號分組，分為實驗組20只，對照組20只。大鼠術(shù)前12h禁食，不禁水，10%戊巴比妥鈉30mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉后，碘伏消毒，正中切口入腹，由十二指腸前壁阻斷膽胰管進(jìn)入十二指腸處開口，經(jīng)胰頭部沿胰腺被膜下插入一號皮試針頭，以0.1mL/min速度勻速注入5%?；悄懰徕c（1mL/kg，Sigma公司），10～30 min后見胰腺出現(xiàn)壞死樣改變后逐層關(guān)腹。假手術(shù)組除胰腺被膜下不注入5%?；悄懰徕c外，余同SAP組。動物成模后于24h活殺取材，檢測有關(guān)指標(biāo)。

1.2.1 胰組織學(xué)檢查及胰腺損傷評分

（1）標(biāo)本取材：成模后24 h活殺動物，迅速分離胰腺組織，經(jīng)%4甲醛固定后制備成石蠟切片（3μm），并將石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE），光鏡觀察。（2）HE染色：（3）采用Grewal等的方法對胰腺組織損傷進(jìn)行定量評估。

1.2.2 胰腺濕重活殺動物后，取胰腺組織立即用分析天平稱濕重。

1.2.3 血清淀粉酶量測定

于成模后24h經(jīng)大鼠右心室穿刺取血，在室溫靜置30 min后，以2500r/min離心，按試劑盒說明測定血清淀粉酶量。

1.2.4 血清α2-巨球蛋白的測定

于成模后24h經(jīng)大鼠右心室穿刺取血，在室溫靜置30 min后，以2500r/min離心，采取ELISA法測定血清α2-巨球蛋白。試劑盒購自美國ADL公司，具體方法參見試劑盒按試劑盒說明。

1.2.5 免疫組化法觀測MMP-2，9的表達(dá)

以特異性的大鼠MMP-2，9多克隆抗體，作免疫組織化學(xué)染色，觀察胰腺組織中MMP-2，9的表達(dá)狀況?；顨⒑笕∫认俳M織，經(jīng)甲醛固定后制備成3μm厚的石蠟切片。具體方法參見試劑盒按試劑盒說明。

MMP-2，9的表達(dá)程度及范圍通過光鏡下觀察。每批染色均設(shè)空白對照（用PBS代替第一抗體）和正常對照（正常胰腺顯色）。結(jié)果與正常對照顯色情況進(jìn)行對比判定。MMP-2，9陽性標(biāo)準(zhǔn)[7，8]：胰腺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)小的棕黃染色顆粒。隨機(jī)觀察5個高倍視野，陰性（-）：無著色細(xì)胞；弱陽性（+）：1個視野可見稀疏顆粒；中等強(qiáng)度陽性（++）：2～4個視野可見顆粒；強(qiáng)陽性（+++）：每個視野均可見彌漫性顆粒。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用χ±s表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料兩組間比較根據(jù)方差齊性與否采用t或t’檢驗；胰腺組織MMP免疫組化的等級資料采用非參數(shù)統(tǒng)計的秩和檢驗。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠胰腺組織損傷評分、胰腺濕重的比較

實驗組胰腺組織損傷評分和胰腺濕重明顯高于對照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組大鼠血清淀粉酶和α2-巨球蛋白含量的比較

實驗組血清淀粉酶及α2-巨球蛋白含量明顯高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組胰腺組織損傷評分、胰腺濕重的比較

表2 兩組血清淀粉酶和α2-巨球蛋白含量的比較

2.3 組織化學(xué)染色結(jié)果

正常大鼠胰腺形態(tài)規(guī)則，排列緊湊，無水腫、出血、壞死等（圖1a）。SAP組肉眼可見胰腺壞死出血灶，光鏡見間質(zhì)腫脹，大量炎細(xì)胞浸潤，紅細(xì)胞滲出，腺泡細(xì)胞和脂肪壞死（圖1b）。

圖1a 對照組胰腺（HE染色10×10）

圖1b SAP組胰腺 （HE染色40×10）

2.4 免疫組化染色結(jié)果

SAP組MMP-2，9呈高表達(dá)，可見胰腺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)小的棕黃染色顆粒。SAP組MMP-2，9表達(dá)陽性率為100%，其中MMP-2強(qiáng)陽性有12例，MMP-9強(qiáng)陽性有9例。而對照組表達(dá)陽性率為10%，其中弱陽性2例。2組間比較差異有顯著性 （P＜0.01）。見表3，4。

表3 兩組胰組織MMP-2的表達(dá)結(jié)果

3 討 論

重癥胰腺炎約占急性胰腺炎的10%～15%，病情篤重，仍是目前較為棘手的急腹癥之一[1，9]。SAP是多因素共同致病的結(jié)果，但SAP的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[2，9]。近年來，對于α2巨球蛋白（α2macroglobulins，α2-M）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在SAP病理生理過程中的作用已成為急性胰腺炎研究非?；钴S的領(lǐng)域，并取得顯著進(jìn)展[9，11]。本實驗旨在通過檢測SAP大鼠胰腺MMP-2，9的表達(dá)及血清中α2-M含量的變化，進(jìn)一步探討SAP發(fā)病機(jī)制，為臨床及時采取措施干預(yù)SAP病情進(jìn)展提供理論依據(jù)。

表4 兩組胰組織MMP-9的表達(dá)結(jié)果

本實驗結(jié)果顯示，SAP組中MMP-2，9在胰腺組織內(nèi)呈高表達(dá)，表現(xiàn)為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外基質(zhì)中棕黃色染色顆粒，而在對照組表達(dá)甚低（P＜0.01），實驗組胰腺損傷評分、胰濕重較對照組明顯升高，實驗組大鼠血清淀粉酶量及反映病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)與MMP-2，9的表達(dá)相一致，提示MMP-2，9與SAP病情的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

有研究表明，在正常情況下MMP-2，9表達(dá)甚微，而在異常情況下，炎癥細(xì)胞被激活后，炎性因子大量釋放，促進(jìn)了MMP-2，9的異常高表達(dá)，從而參與病理過程加劇病情的發(fā)展[7，11]。我們通過免疫組化染色法觀察SAP大鼠胰腺MMP-2，9的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，MMP-2，9在對照組無表達(dá)或僅有個別弱陽性表達(dá)，而實驗組大鼠則呈強(qiáng)陽性表達(dá)；通過組化HE染色還觀察到大量白細(xì)胞遷移，浸潤至周圍組織，同時伴有毛細(xì)血管擴(kuò)張、淤血，周圍組織充血、壞死，膿腫形成。由此，我們發(fā)現(xiàn)在MMP-2，9呈陽性表達(dá)的同時中性粒細(xì)胞大量浸潤至細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)，而中性粒細(xì)胞本身可以釋放多種炎性因子，進(jìn)而推測病變組織中中性粒細(xì)胞的大量浸潤與MMP-2，9的高表達(dá)密切相關(guān)。在Keck等的實驗中發(fā)現(xiàn)在重癥急性胰腺炎大鼠的肺勻漿和含中性粒細(xì)胞的上清液中，MMP-9高表達(dá)[8]。用中性粒細(xì)胞損耗試驗消耗外周血中的白細(xì)胞后，肺組織中性粒細(xì)胞浸潤減輕的同時，MMP-9表達(dá)亦隨之降低，這表明高表達(dá)的MMP-9來源于中性粒細(xì)胞。免疫熒光研究也證實了浸潤肺組織的中性粒細(xì)胞表達(dá)MMP-9[12]，結(jié)合我們的實驗觀測進(jìn)一步證明了這一推斷。

在Muhs及Descamps等的實驗中發(fā)現(xiàn)，SAP時肺通透性增加了2倍，肺勻漿MMP-2活性在ANP中3倍于正常對照組，腹水中MMP-2、9的活性增加[6]。Yamaguchi等在油酸誘導(dǎo)的急性胰腺炎大鼠中發(fā)現(xiàn)，MMP-2活性較誘導(dǎo)前顯著增強(qiáng)，MMP-2mRNA表達(dá)升高12.3倍[10]。Yamaguchi等在蛙皮素和牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)的胰腺炎大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，Ⅳ型膠原沿基底膜亦呈連續(xù)性分布（不同于精氨酸誘導(dǎo)的胰腺炎模型）。而MMP-2在導(dǎo)管上皮的染色強(qiáng)度又與導(dǎo)管周圍基底層的Ⅳ型膠原呈負(fù)相關(guān)[13，14]?？梢奙MP-2在急性胰腺炎中的激活和持續(xù)高表達(dá)，導(dǎo)致胰腺基底膜和間質(zhì)中的Ⅳ型膠原降解，引起胰腺腺泡和導(dǎo)管上皮結(jié)構(gòu)的破壞。

綜合我們的實驗結(jié)果及既往研究，我們認(rèn)為SAP的病理演變過程可能為前炎癥因子（TNF-α、IL-1β等）發(fā)揮著始動作用，刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)增加，從而通過細(xì)胞黏附因子（ICAM-1、VCAM-1等）粘附于內(nèi)皮細(xì)胞層并通過內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)基底基質(zhì)膜，激活體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，各種激酶活化之后使底物磷酸化，增強(qiáng)核因子的DNA結(jié)合活性，從而誘導(dǎo)MMP-2，9表達(dá)，最終通過MMP-2，9作用胰腺毛細(xì)血管，破壞基膜，令胰腺毛細(xì)血管通透性增加，使中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞穿透屏障遷移于ECM及腺泡內(nèi)，繼續(xù)釋放MMP-2，9，加重結(jié)構(gòu)破壞，使AP進(jìn)展至SAP[11，18]。據(jù)此提示我們MMP-2及MMP-9可作為SAP病情判定的良好指標(biāo)[19]。而Yokota等在蛙皮素誘導(dǎo)的急性胰腺炎中，MMP-1和MMP-2均明顯升高；而MMP-9變化不大[7]，這與本次實驗結(jié)果不同，我們考慮可能由于不同的誘導(dǎo)劑所引起的胰腺炎模型，其炎癥組織的病理變化不同所致。

作為體內(nèi)最廣譜的蛋白水解酶抑制劑[20]，α2-M在大多數(shù)正常情況下其體內(nèi)濃度不發(fā)生變化。我們的實驗結(jié)果顯示α2-M在實驗組大鼠血清含量中升高顯著，這與Bisaro等的研究結(jié)果相一致[2]。研究證實，基質(zhì)金屬蛋白酶家族是細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中的重要酶類，而α2-M對基質(zhì)金屬蛋白酶有抑制作用，它是重要的MMP清除劑，可以非特異性抑制和清除血漿中的MMP[19]。α2-M可用其特殊的“陷阱”機(jī)制，把蛋白酶緊緊包裹其中，阻斷其與底物發(fā)生反應(yīng)。α2-M的這種生理功能是否可以阻止MMP發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步研究[19]。Bisaro等發(fā)現(xiàn)在AP的血清中α2-M和MMP-2，9活性均有所增加，但MMP-2，9的增加總是高于α2-M[20]，結(jié)合我們的實驗結(jié)果推測可將測定血清中α2-M的活性作為評估SAP病情的一項指標(biāo)。

綜合本次實驗及既往文獻(xiàn)報道，均提示 MMP-2、MMP-9與α2-M的含量平衡失調(diào)是SAP發(fā)生發(fā)展的重要發(fā)病機(jī)制之一，我們對MMP-2，9及α2-M關(guān)系的深入研究，有望進(jìn)一步闡明急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制。我們認(rèn)為在診治SAP患者過程中測定MMP-2，9的同時測定α2-M含量將更有利于提高SAP的預(yù)測與診斷，有助于臨床及早采取治療措施干預(yù)并阻斷SAP的病理發(fā)展進(jìn)程、減輕SAP對機(jī)體的損害、降低SAP患者的死亡率。

[1]Domínguez-Munoz JE.Advances in acute pancreatitis[J].Gastroenterol Hepatol,2008,4：70-75.

[2]Papachristou GI.Prediction of severe acute pancreatitis：current knowledge and novel insights[J].World J Gastroenterol,2008,14(41)：6273-6275.

[3]Bísaro de Lorenc L,Ramos AM,Sánchez MC.Structural evaluation of plasma alpha2-macroglobulin in acutepancreatitis[J].Clin Chem Lab Med,2005,43(11)：1183-1189.

[4]L?hr M,Hummel F,Martus P,Serum levels of extracellular matrix in acute pancreatitis[J].Hepatogastroenterology,1999,46(30)：3263-3270.

[5]Aynaci M,Tuncyurek P,Nart D.Does matrix metalloproteinase activity predict severity of acute pancreatitis?[J].ANZ J Surg,2006,76(9)：801-804.

[6]Muhs BE,Patel S,Yee H,Increased matrix metalloproteinase expression and activation following experimental acute pancreatitis[J].J Surg Res,2001,101(1)：21-28.

[7]Yokota T,Denham W,Murayama K.Pancreatic stellate cell activation and MMP production in experimental pancreatic fibrosis[J].J Surg Res,2002,104(2)：106-111.

[8]Keck T,Balcom JH 4th,Fernández-del Castillo C.Matrix metalloproteinase-9 promotes neutrophil migration and alveolar capillary leakage in pancreatitis-associated lung injury in the rat[J].Gastroenterology,2002,122(1)：188-201.

[9]Werning C.Pancreatitis[J].Med Monatsschr Pharm,1984,7(3)：68-69.

[10]Yamaguchi T,Kihara Y,Taguchi M,Persistent destruction of the basement membrane of the pancreatic duct contributes to progressive acinar atrophy in rats with experimentally induced pancreatitis[J].Pancreas,2005,31(4)：365-372.

[11]Chen P,Yuan Y,Wang S,Zhan L,Serum matrix metalloproteinase 9 as a marker for the assessment of severe acute pancreatitis[J].Tohoku J Exp Med,2006,208(3)：261-266.

[12]Keck T,Jargon D,Klünsch A,MMP-9 in serum correlates with the development of pulmonary complications in experimental acute pancreatitis[J].Pancreatology,2006,6(4)：316-322.

[13]Yamaguchi T,Nakamura H,Kihara Y.Long-term overexpression of membrane type-1 matrix metalloproteinase and matrix metalloproteinase-2 in oleic acid-induced pancreatitis in rats[J].Pancreas,2002,24(4)：348-356.

[14]Ng EK,Barent BL,Smith GS,Joehl RJ.Decreased type IV collagenase activity in experimental pancreatic fibrosis[J].J Surg Res,2001,96(1)：6-9.

[15]Kruse P,Lasson A,Hage E.Proteases and protease inhibitors in cerulein-induced acute pancreatitis in rats[J].J Surg Res,1999,85(2)：294-300.

[16]Georgiadis D,Yiotakis A.Specific targeting of metzincin family members with small-molecule inhibitors：progress toward a multifarious challenge[J].Bioorg Med Chem,2008,16(19)：8781-8794.

[17]Lipka D,Boratyński J.Metalloproteinases[J].Structure and function Postepy Hig Med Dosw,2008,62：328-36.

[18]Ghajar CM,George SC,Putnam AJ.Matrix metalloproteinase control of capillary morphogenesis[J].Crit Rev Eukaryot Gene Exp,2008,18(3)：251-278.

[19]Tu G,Xu W,Huang H,Li S.Progress in the development of matrix metalloproteinase inhibitors[J].Curr Med Chem,2008,15(14)：1388-1395.

[20]Meng N,Li Y,Zhang H.RECK,a novel matrix metalloproteinase regulator[J].Histol Histopathol,2008,23(8)：1003-1010.