熒光分光光度法測定大鼠不同腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

張 燕，王洪斌*，楊海霞，陳 清，趙 麗

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是中樞神經(jīng)內(nèi)重要的信息傳遞物質(zhì)，參與鎮(zhèn)痛、軀體運動、精神情緒活動、睡眠、覺醒、應(yīng)激等多種生理過程[1]，特別是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑制起著協(xié)調(diào)作用[2-4]。本試驗根據(jù)去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）與氧化劑反應(yīng)生成具有熒光的化合物，5-羥色胺（5-HT）在堿性條件下與OPT縮合形成具有熒光的化合物，上述熒光化合物強度與濃度成直線關(guān)系，即可通過測定其熒光強度而求得其濃度[5]，同時測定了大鼠不同腦區(qū)三種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，此方法檢測速度快，結(jié)果可靠。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年Wista大鼠，體重225±32 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供，實驗動物許可證號為SCXK（京2007-0001）。

1.2 儀器

970CRT型熒光分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16G高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；快速混勻器（江蘇中大儀器廠）；電子分析天平；玻璃勻漿器。

1.3 主要試劑及配制

標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma公司：鹽酸去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE），批號為 74460；多巴胺（Dopamine，DA），批號為H8502；5-羥色胺（5-hydroxy-tryptamine，5-HT），批號為H7752。三種標(biāo)準(zhǔn)品以0.01 mol·L-1HCl分別配成濃度為1 g·L-1的儲備液，置4℃冰箱，臨用前用0.01 mol·L-1HCl稀釋定容至濃度為1.5 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

鄰苯二甲醛（O-phthaldialdenyde，OPT），分析純（批號061214），上海盈元化工有限公司。以10 mol·L-1HCl配制成0.004%的濃度，4℃儲存。

L-半胱氨酸（L-Cysteine），生化試劑（批號071008），上?；菔郎噭┯邢薰尽ＥR用前用0.1 mol·L-1HCl配制成1%的溶液。

堿性Na2SO3溶液（AR）：0.25 g Na2S03溶于9 mL 5 mol·L-1NaOH中，再加l mL水混勻，臨用前配制。

pH 7.0磷酸鹽緩沖液：貯藏液甲，7.1 g Na2HPO4溶于500 mL雙蒸水中；貯藏液乙，6.9 g NaH2PO4溶于500 mL雙蒸水中。甲、乙兩種液體貯于4℃冰箱中，臨用前取甲液32 mL，乙液68 mL，兩液混勻為pH 7.0的0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液。

酸性正丁醇：500 mL正丁醇（AR）中加濃鹽酸0.43 mL；正庚烷（AR）。

0.1 mol·L-1碘試液：KI 10 g溶于雙蒸水后，加入I22.5 g，再加雙蒸水至200 mL，貯于棕色瓶中，避光保存。

0.1 mol·L-1EDTA 溶液：取 EDTA-Na2·2H2O 3.71 g 溶于 95 mL NaAc（l mol·L-1）溶液加到 100 mL，貯于冰箱備用。

1.4 樣品預(yù)處理

大鼠斷頭處死，立即取腦組織，用冰生理鹽水沖洗后在生理鹽水冰面上迅速分離雙側(cè)大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干，分別稱重后立即-80℃冷凍保存。取大鼠腦組織置于玻璃勻漿器中，加少量冷酸化正丁醇，冰浴中勻漿，加冷酸化正丁醇至10倍量，3 000 r·min-1離心5 min。取上清液2.5 mL，加正庚烷5 mL、0.l mol·L-1HCl l.2 mL，漩渦振蕩 5 min，4 ℃離心（3 000 r·min-1，5 min），分離水相與有機相。

1.5 線性關(guān)系試驗

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1、10、20、30、50、100、200、400 μL，分別加雙蒸水至 0.4 mL，依次加 pH 7.0磷酸鹽緩沖液 1.5 mL、0.1 mol·L-1EDTA溶液0.4 mL、碘試液0.1 mL，反應(yīng)2 min，加堿性Na2SO3溶液0.4 mL，反應(yīng)2 min，加6 mol·L-1HAc 0.4 mL，沸水浴2 min，迅速冷卻，于484/385 nm波長測定NE熒光強度，再將反應(yīng)液沸水浴加熱20 min，移入冷水中冷卻，376/323 nm波長處測定DA熒光強度。

另取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1、10、20、30、50、100、200、400 μL，分別加雙蒸水至 0.4 mL，依次加入l%L-Cys 0.l mL、0.004%OPT-鹽酸溶液3 mL，0.02%NaIO4溶液0.l mL，沸水浴加熱10 min，迅速冷卻，于480/356 nm測定5-HT熒光強度。

1.6 重復(fù)性試驗

取同一份大鼠丘腦組織按上述試驗方法進行5次重復(fù)試驗。

1.7 回收率試驗

將一份已知濃度的丘腦組織勻漿液分成3份，分別加入等體積的低、中、高三種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，進行樣本提取并測定其熒光強度。

1.8 NE、DA和5-HT的提取與測定

取1.4處理后的水相0.4 mL，依照1.5的方法測定NE和DA熒光強度。

另取1.4處理后的水相0.4 mL，依照1.5的方法測定5-HT熒光強度。

1.9 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

按1.5試驗步驟測樣，將測得的熒光強度值（Y）對標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X）進行線性回歸，求得回歸方程Y=aX+b和相關(guān)系數(shù)R2，結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，NE、DA和5-HT的熒光強度與其濃度呈直線關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均達0.99，表現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表1 線性方程和相關(guān)系數(shù)Table1 Date for linear equation and correlation coefficients

2.2 重復(fù)性試驗

按1.6進行重復(fù)性試驗，結(jié)果測得NE、DA和5-HT含量的變異系數(shù)分別為7.6%、3.7%和7.5%，表明該檢測方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。

2.3 回收率試驗

按1.7進行試驗，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明NE、DA和5-HT的平均回收率分別為102.2%、95.4%和102.8%，其回收率均在95%以上，表明該檢測方法可靠、檢出率較高。

2.4 大鼠不同腦區(qū)NE、DA和5-HT的含量

按1.8進行試驗，分別測定大鼠大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干中NE、DA和5-HT的含量，結(jié)果見表3。

表2 回收率試驗結(jié)果（，n=3）Table2 Results of recovery(,n=3)

表2 回收率試驗結(jié)果（，n=3）Table2 Results of recovery(,n=3)

表3 大鼠不同腦區(qū)NE、DA和5-HT的含量(，n=12）Table3 Contents of NE,DA and 5-HT in different encephalic regions in rat(,n=12)(ng·g-1)

表3 大鼠不同腦區(qū)NE、DA和5-HT的含量(，n=12）Table3 Contents of NE,DA and 5-HT in different encephalic regions in rat(,n=12)(ng·g-1)

結(jié)果表明，大鼠不同腦區(qū)NE、DA和5-HT的含量存在差異，在各腦區(qū)中，NE含量最高，DA含量最低。

3 討論與結(jié)論

3.1 腦組織的處理與腦分區(qū)

本試驗根據(jù)Welch的剪刀斷頭，直接取腦的方法[5]，按照腦的解剖結(jié)構(gòu)劃分腦區(qū)，此法簡單迅速，鼠腦一般在30 s內(nèi)可取出。取出的腦組織用冰生理鹽水沖洗后置于生理鹽水冰面上，不但使酶活性迅速降低，而且方便腦組織的分區(qū)。

3.2 試劑與振蕩方式

本文預(yù)試驗曾比較了重蒸與未重蒸正丁醇、正庚烷及手工劇烈振蕩5 min與旋渦振蕩30 s對提取過程的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測單胺類物質(zhì)的熒光強度無明顯差異，說明可直接使用分析純正丁醇和正庚烷，并可將手動劇烈振蕩5 min改為旋渦振蕩30 s，節(jié)省了時間與人力。在Shellenberger等[6]報道的方法中，正丁醇、正庚烷需重蒸，振蕩時間也較長。

3.3 樣品熒光的穩(wěn)定性

本文預(yù)試驗曾將8份樣品發(fā)生熒光后4℃保存，于1、2、4、8、12、24、48和72 h分別測定其熒光強度，發(fā)現(xiàn)DA和5-HT熒光強度較穩(wěn)定，但是NE熒光強度隨時間延長而減弱，因此建議樣品在發(fā)生熒光后應(yīng)立即測定，尤其是NE需在1～2 h內(nèi)完成，否則其熒光強度急速減弱。

3.4 最適反應(yīng)條件

試驗結(jié)果表明，熒光強度隨著磷酸緩沖液pH增大而增強，在pH 6.5～7.5時熒光強度最大，本試驗選用pH 7.0；熒光強度隨著煮沸時間延長而下降，應(yīng)將煮沸時間控制在20 min內(nèi)；熒光強度隨著OPT濃度升高而降低，故選用0.004%的OPT測定5-HT。上述試驗條件與蔣曉玲、歐玉清等人選擇的試驗條件基本一致[7-10]。試驗所用試劑均為分析純，用雙蒸水配制，器皿用雙蒸水沖洗。

經(jīng)典的單胺類物質(zhì)熒光測定法程序繁瑣，條件復(fù)雜[6]，而高效液相色譜法雖然靈敏度高，但需要昂貴高效液相色譜儀，且易受其他物質(zhì)的干擾等缺點。本文采用熒光分光光度法測定大鼠不同腦區(qū)NE、DA和5-HT的含量，試驗成本低、樣品處理量大，試驗結(jié)果表明，此方法靈敏度高、重復(fù)性好、結(jié)果可靠、簡便易行，可以為廣大醫(yī)務(wù)工作者和科研人員進行臨床監(jiān)測及科學(xué)實驗提供參考。

[1]Shepherd G M.神經(jīng)生物學(xué)[M].上海:復(fù)旦大學(xué)出版社,1992:352.

[2]Gonzalez M M,Aston-Jones G.Light deprivation damages monoamine neurons and produces a depressive behavioral phenotype in rats[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(12):4898.

[3]Won J J,Kim N Y,Ryu V,et al.Dexamethasone reduces food intake,weight gain and the hypothalamic 5-HT concentration and increases plasma leptin in rats[J].Eur J Pharmacol,2008,581(1-2):64.

[4]Park S S,Schulz E M,Lee D.Disruption of dopamine homeostasis underliesselective neurodegeneration mediatedby alpha-synuclein[J].Eur J Neurosci,2007,26(11):3104.

[5]Weleh A S.Solvent extraetion method for simultaineous determination of norepinephrine,dopamine,serotonin and 5-hydroxyindolacetic acid in single mouse brain[J].Anal Biochem,1969,30:161.

[6]Shellenberger M K,Gordon J K.A rapid,simplified procedure for simul-taneous assay of norepinephrine,dopamine and 5-hytroxytry-ptamine from discrete brain area[J].Anal Biochem,1971,39:356-372.

[7]蔣曉玲.熒光法測定大鼠腦組織和血液中單胺類物質(zhì)的方法探討[J].南京體育學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2002,1(4):85-87.

[8]歐玉清,邢繼強,韓玉澤.采用熒光法同時測定鼠腦中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),1998,21(4):1-2.

[9]高幸玲.清風(fēng)膠囊對嗎啡依賴大鼠戒斷后焦慮行為及腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[D].廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2008:26-31.

[10]張熠,顧振綸,蔣小崗.夏天無總堿提取物對癡呆大鼠腦內(nèi)5-HT和DA含量的影響[J].蘇州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2004,24(2):134-137.