利用AFLP技術(shù)篩選與哲羅魚Hucho taimen(Pallas)性別相關(guān)的分子標(biāo)記

張 超， 佟廣香，匡友誼，張春雷,3，尹家勝*

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

哲羅魚 Hucho taimen（Pallas）系鮭形目（Salmoniformes）、鮭科（Salmonidae）、哲羅魚屬（Hucho），是兇猛的大型冷水魚類。哲羅魚具有生長速度快、營養(yǎng)價值高等優(yōu)良特性，是冷水性魚類中較好的馴養(yǎng)品種，目前馴化養(yǎng)殖及人工繁育已經(jīng)獲得成功。哲羅魚繁殖[1]，生理學(xué)及染色體核型方面的研究國內(nèi)已有報道[2-4]，在分子生物學(xué)方面，國內(nèi)有利用微衛(wèi)星和AFLP對哲羅魚遺傳多樣性研究的報道[5-7]，國外有對虹鱒的性別基因位點(diǎn)及鮭科魚類性染色體進(jìn)行研究[8-11]，但在分析哲羅魚性別相關(guān)的分子標(biāo)記方面，尚未見有報道。

AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism of DNA）技術(shù)結(jié)合了RFLP的穩(wěn)定性和PCR的高效性，具有多態(tài)性豐富、DNA用量少、無需預(yù)知基因組的序列信息等特點(diǎn)[12]。已廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[13]、遺傳多樣性分析[14]、重要性狀的分子標(biāo)記篩選等方面[15]。利用AFLP技術(shù)進(jìn)行動物性別相關(guān)分子標(biāo)記的尋找，國內(nèi)外研究相對較少。相關(guān)的研究主要集中在植物領(lǐng)域[16-17]。在水產(chǎn)動物方面，僅在建鯉[18]、尼羅羅非魚[19-20]、半滑舌鰨[21-22]、虹鱒[10,23]、大西洋鮭[24]等幾種魚類中獲得與性別相關(guān)的分子標(biāo)記，且在這些獲得的標(biāo)記中，大部分標(biāo)記與性別的連鎖關(guān)系還有待于進(jìn)一步確定。而且有報道指出目前得到的一些性別特異標(biāo)記具有很高的種系特異性[20]。本研究利用AFLP技術(shù)分析雌雄哲羅魚DNA水平的差異，尋找與性別相關(guān)的分子標(biāo)記，以期為哲羅魚的性別鑒定及單性養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

哲羅魚雌雄各10尾，體長范圍為70.2～104 cm，體重范圍為2.428～12.680 kg，均采自黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚實(shí)驗(yàn)站，在性成熟期鑒定雌雄后剪取鰭條，于75%酒精中保存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測

將鰭條樣品在超純水中反復(fù)清洗多次，使乙醇完全揮發(fā)，提取方法參照文獻(xiàn)[25]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用分光光度計測定其純度和濃度，然后將DNA濃度調(diào)整至100 ng·μL-1備用。

1.2.2 AFLP分析

用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ/TaqⅠ組合和Eco RⅠ/Tru9Ⅰ組合分別對基因組DNA進(jìn)行雙酶切，然后T4DNA連接酶進(jìn)行連接。具體操作步驟參照文獻(xiàn)[26]。接頭序列如下：

以連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增引物和選擇性引物序列見表1，擴(kuò)增產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺為29：1）凝膠電泳檢測，上樣5 μL，在恒壓（380 V）條件下電泳11 h后銀染，掃描儀成像。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Gel-pro4.5軟件分析獲得的AFLP電泳圖譜，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)100 bp DNA Ladder計算擴(kuò)增片段的大小。統(tǒng)計方法參照文獻(xiàn)[26]，用Philip3.6軟件和TreeView軟件進(jìn)行個體聚類分析，Bootstrap抽樣5 000次。

表1 引物序列Table1 Primers sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析

用25對E/PT引物組合和20對E/T引物組合對20尾哲羅魚個體進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，25對E/PT引物組合共擴(kuò)增出了958個位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)為251個，多態(tài)性比例在4.76%～62.26%之間，平均多態(tài)性比例為25.068%；20對E/T引物組合共擴(kuò)增出了971個位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)為217個，多態(tài)性比例在6.98%～37.50%之間，平均多態(tài)性比例為22.175%，結(jié)果見表2。從表中可以看出，兩組酶切組合得出的結(jié)果相差不大，E/T引物組合擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)稍多于E/PT引物組合，但多態(tài)性位點(diǎn)比例稍低于后者。綜合兩組數(shù)據(jù)來看，這20尾哲羅魚之間的多態(tài)性位點(diǎn)比例并不是很高，多態(tài)水平一般。

表2 哲羅魚中不同引物組合擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)性位點(diǎn)比例Table2 Number of loci and ratio of polymorphic loci amplified by different AFLP primers in H.taimen

圖1為引物組合E3-PT3擴(kuò)增的結(jié)果，圖2為引物組合E1-T8擴(kuò)增的結(jié)果，多態(tài)性比例分別為25.00%和41.46%。 圖中標(biāo)號1～10為雌魚，11～20為雄魚，箭頭所指處為多態(tài)位點(diǎn)，圖1中有兩個多態(tài)位點(diǎn)，圖2中有一個多態(tài)位點(diǎn)，這三個多態(tài)位點(diǎn)在雌雄哲羅魚中擴(kuò)增出的比例存在一定的差異，說明這些多態(tài)位點(diǎn)與哲羅魚性別可能存在一定的相關(guān)性。

圖1 E3-PT3的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Electrophoretogram of H.taimen population amplified by primer combination E3-PT3

圖2 E1-T8的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Electrophoretogram of H.taimen population amplified by primer combination E1-T8

2.2 雌雄個體差異

分析45對引物組合的擴(kuò)增結(jié)果，有15個位點(diǎn)在雌性和雄性個體中出現(xiàn)的比例存在很大的差異（大于50%），如引物組合E3-PT6擴(kuò)增的分子質(zhì)量為115 bp的位點(diǎn)在10個雄性個體中出現(xiàn)8個，而10個雌性個體中僅有1個出現(xiàn)；引物組合E2-T2擴(kuò)增的分子質(zhì)量為603 bp的位點(diǎn)在10個雌性個體中都有出現(xiàn)，而在10個雄性個體中只出現(xiàn)3個，結(jié)果見表3。這15個位點(diǎn)中雖然沒有找到哲羅魚雌雄特異位點(diǎn)，但每個位點(diǎn)在雌雄中擴(kuò)增的比例相差都在50%以上，表明這些位點(diǎn)與哲羅魚性別存在很大的相關(guān)性，這些位點(diǎn)可能位于性染色體上或者性別決定基因附近區(qū)域。

利用popgene3.2版軟件計算雌雄兩個群體的觀測等位基因Na、有效等位基因Ne，Nei氏基因多樣性指數(shù)H和Shannon氏指數(shù)I，結(jié)果見表4、5。由表中可以看出，兩組酶切組合所得到的結(jié)果不同，E/PT組合獲得的遺傳多樣性參數(shù)是雌性略高于雄性，而E/T組合則是雄性略高于雌性，總體來看，兩組酶切組合得出的數(shù)據(jù)均較低，由此可以得出哲羅魚群體遺傳多樣性較低，但將雌雄群體分開來看，兩群體之間遺傳多樣性參數(shù)差異并不大，說明在進(jìn)化過程中雌雄群體的遺傳分化程度不大，所以從DNA角度來看，哲羅魚雌雄群體之間的差別不大，多態(tài)性水平一般。

表3 哲羅魚雌雄個體在15個位點(diǎn)出現(xiàn)的比例差異Table3 Differences of distribution in 15 loci between female and male groups of H.taimen

表4 E/PT組合獲得的遺傳多樣性參數(shù)Table4 Parameters of genetic diversity by E/PT combination

表5 E/T組合獲得的遺傳多樣性參數(shù)Table5 Parameters of genetic diversity by E/T combination

用Phylip3.6軟件計算遺傳距離，并進(jìn)行5 000次Bootstrap檢驗(yàn)系統(tǒng)樹的可靠性，圖3是由表3中的15個位點(diǎn)繪制的哲羅魚個體聚類圖。從圖3可以看出雌魚聚集在系統(tǒng)樹上部，雄魚聚集在系統(tǒng)樹下部，這說明相同性別的魚之間遺傳距離較近，優(yōu)先聚為一組，而與不同性別的魚之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，這也同樣表明這15個多態(tài)位點(diǎn)與哲羅魚性別之間存在很大的相關(guān)性。

圖3 哲羅魚個體聚類圖Fig.3 Individuals dendrogram of H.taimen

3 討論與結(jié)論

AFLP標(biāo)記技術(shù)能產(chǎn)生分布于整個基因組的分子標(biāo)記，位點(diǎn)豐富，但是操作過程繁瑣，任何一步的疏忽都會影響試驗(yàn)結(jié)果。本試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[26]采用了最適的酶量、酶切時間、連接時間及選擇性擴(kuò)增時的稀釋倍數(shù)，將100 ng DNA用3 U的Eco RⅠ、3 U的TaqⅠ和Tru9Ⅰ分別先后酶切3、4 h，然后用2 U的T4DNA連接酶連接3 h，取3 μL連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，得到了最可靠的結(jié)果。

本研究用45對引物組合進(jìn)行試驗(yàn)分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)與性別相關(guān)的特異性位點(diǎn)，但某些位點(diǎn)在雌雄個體中出現(xiàn)的比例存在很大的差異。這些位點(diǎn)可能與哲羅魚的性別有一定的關(guān)聯(lián)，推測這些位點(diǎn)可能位于性別決定基因的相鄰區(qū)域，但與哲羅魚遺傳性別的確切關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。雌雄個體出現(xiàn)比例差異較大的15個位點(diǎn)的聚類分析結(jié)果也表明雌雄個體具有一定的遺傳分化，同性個體優(yōu)先聚類。

鮭科魚類性別方面的研究多是國外學(xué)者們進(jìn)行的，主要集中在對虹鱒的研究。Iturra等利用RAPD方法獲得兩個虹鱒雄性特異分子標(biāo)記，并將其中一個標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，命名為OmyP9，然后將其作為探針，采用FISH法將該標(biāo)記定位于Y染色體上[10]；同時，還采用FISH法，利用虹鱒的性別標(biāo)記OmyP9和5s rDNA、GH2基因作為FISH法的探針，特征化了虹鱒性別染色體，并鑒別了銀大麻哈魚的性染色體[27]，這表明OmyP9這個性別標(biāo)記在虹鱒和銀大麻哈魚中可以通用。虹鱒和銀大麻哈魚同屬鮭科魚類的大麻哈魚屬，所以這些性別標(biāo)記在屬內(nèi)并不存在種系特異性；Felip等將虹鱒15個性別相關(guān)AFLP分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，并在虹鱒四個遺傳多態(tài)的雄性克隆系內(nèi)將其中一個Y染色體連鎖標(biāo)記Omy-163定位于性別位點(diǎn)附近[23]；Alfaqih等將虹鱒5個候選性別決定基因與Y染色體進(jìn)行了連鎖[8]，Brunelli等已經(jīng)成功獲得了虹鱒的Y染色體序列[28]。由此可見，虹鱒的性染色體已經(jīng)確定為Y染色體，而且已經(jīng)獲得了Y染色體的序列及多個性別相關(guān)的分子標(biāo)記和候選性別決定基因。本文作者根據(jù)已公布的虹鱒的OmyP9、Omy-163和GH2基因等性別標(biāo)記的序列設(shè)計了18對引物，采用SSCP技術(shù)篩選哲羅魚性別的分子標(biāo)記，未能發(fā)現(xiàn)哲羅魚雌雄差異。這可能是由于虹鱒和哲羅魚雖同屬鮭科，但不同屬，而性別標(biāo)記又存在屬間特異性，所以虹鱒的性別標(biāo)記不能應(yīng)用于哲羅魚。既然哲羅魚與虹鱒同屬鮭科魚類，在遺傳進(jìn)化方面存在許多共同之處，可以參考虹鱒性別方面的研究方法對哲羅魚性染色體及性別相關(guān)分子標(biāo)記進(jìn)行研究。

分析本研究未發(fā)現(xiàn)性別特異位點(diǎn)的可能原因有以下兩方面：①AFLP技術(shù)是針對于整個基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增，而與性別相關(guān)的基因數(shù)量較少，因此采用該技術(shù)尋找哲羅魚雌雄之間的差異存在一定的困難；②本研究所用的引物組合較少，樣本量也較少，所以擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)不是很多，若采用多種雌雄差異分析方法，或者選用更多的選擇性擴(kuò)增引物，改進(jìn)電泳條件，檢測更多的雌雄差異位點(diǎn)，將更有助于尋找到雌雄特異位點(diǎn)。另外，魚類的性別不僅與遺傳因素有關(guān)，還與環(huán)境因素有一定的關(guān)系，可以分為遺傳性別和生理性別，遺傳性別和生理性別的不統(tǒng)一也會造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的不準(zhǔn)確，在某些雌雄出現(xiàn)比例差異很大的位點(diǎn)上，如E2-PT3，雄性個體均有出現(xiàn)，而雌性個體只有3個出現(xiàn)，這3個個體有可能在生理上屬雌性，而在遺傳上屬雄性，因此用性別特異位點(diǎn)鑒定性別時，其準(zhǔn)確性并不能夠達(dá)到100%，即使獲得某個雌雄特異位點(diǎn)，擴(kuò)大樣本量分析時也不能保證其能夠完全鑒定出雌雄。

哲羅魚是我國的瀕危物種，同時也是一個優(yōu)良的淡水養(yǎng)殖品種。哲羅魚的雌雄從外形上很難分辨，因此開發(fā)哲羅魚性別的特異性標(biāo)記，對其進(jìn)行性別鑒定，可以對雌雄群體進(jìn)行不同性狀的定向選育，形成不同性狀的優(yōu)良品種；或分別對雌雄群體進(jìn)行雜交獲得具有雜種優(yōu)勢的后代。本文雖然沒有找到哲羅魚雌雄特異位點(diǎn)，但該研究積累的大量AFLP分析結(jié)果和數(shù)據(jù)，可作為哲羅魚的遺傳背景資料，為哲羅魚性別或其他方面的進(jìn)一步研究提供參考。

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