嗜鹽菌群在甲苯降解過(guò)程中群落結(jié)構(gòu)的變化解析

蔣 婧,王 慧*,張麗花,毛心慰,閆 海

(1.清華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系,環(huán)境模擬與污染控制國(guó)家重點(diǎn)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,北京 100084；2.北京科技大學(xué)應(yīng)用科學(xué)學(xué)院,北京 100083)

嗜鹽菌群在甲苯降解過(guò)程中群落結(jié)構(gòu)的變化解析

蔣 婧1,王 慧1*,張麗花2,毛心慰1,閆 海2

(1.清華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系,環(huán)境模擬與污染控制國(guó)家重點(diǎn)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,北京 100084；2.北京科技大學(xué)應(yīng)用科學(xué)學(xué)院,北京 100083)

從勝利油田的高鹽油污土壤中富集到1個(gè)高效降解BTEX(苯、甲苯、乙苯、二甲苯)的嗜鹽菌群,分析了菌群在甲苯降解過(guò)程中的群落結(jié)構(gòu)變化.結(jié)果表明,該菌群在 5%鹽度下可完全降解 200mg/L甲苯.PCR-DGGE圖譜顯示,隨著甲苯的加入,該菌群的優(yōu)勢(shì)種屬由Bacillus sp.和Bacillus aquimaris轉(zhuǎn)變?yōu)門halassospira xiamenensis、Pseudomonas stutzeri、Virgibacillus sp.和Bacillus sp..這4種微生物在整個(gè)降解過(guò)程中穩(wěn)定存在,且在降解完成后24h內(nèi)沒(méi)有衰亡的跡象.另外,該菌群可以降解菲,顯示了降解多種芳香族化合物的能力.

BTEX；嗜鹽菌群；PCR-DGGE；微生物群落結(jié)構(gòu)

Abstract：A halophilic bacterial consortium that could degrade BTEX (benzene, tolunene, ethybenzene, xylene) at the salinity of 5% was enriched from oil-contaminated saline soil. Bacterial community structure dynamics in toluene degradation by the consortium was analyzed. The consortium could degrade 200 mg/L toluene at the salinity of 5%. PCR-DGGE profiles revealed that with toluene addition, the predominant species shifted from Bacillus sp. and Bacillus aquimaris to Thalassospira xiamenensis, Pseudomonas stutzeri, Virgibacillus sp. as well as Bacillus sp., four of which remained stable during the degradation process and the following 24h when toluene was depleted. In addition, the consortium could degrade phenanthrene, illustrating its versatility in utilizing aromatic hydrocarbons.

Key words：BTEX；bacterial halophilic consortium；PCR-DGGE；microbial community structure

BTEX包括苯、甲苯、乙苯和二甲苯,屬于單環(huán)芳烴類物質(zhì),對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用[1],并對(duì)人體生殖發(fā)育產(chǎn)生毒性效應(yīng)[2-5]. BTEX是石油中芳香族化合物的主要成分,而石油污染常常伴隨著高鹽環(huán)境[6-7].我國(guó)陸上油田土壤的含鹽量普遍較高,如中原油田、遼河油田和勝利油田的土壤含鹽度分別為 7,9,15g/kg[8].另一方面,在石油開(kāi)采過(guò)程中產(chǎn)生的大量落地原油及含鹽石油廢水(鹽度>3.5% W/V)的排放均導(dǎo)致油污土壤具有高鹽特征,對(duì)普通微生物的正常代謝產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,因而修復(fù)效果很不理想[6].

目前,高鹽環(huán)境下微生物對(duì)污染物的降解已受到廣泛關(guān)注.許多嗜鹽細(xì)菌或菌群從受污染的環(huán)境中被分離或富集,它們?cè)谝欢}度范圍內(nèi)能降解烷烴、多環(huán)芳烴、BTEX、石油、柴油等污染物[7,9-12].由于菌群的結(jié)構(gòu)與其降解功能密切相關(guān),所以研究嗜鹽菌群群落結(jié)構(gòu)在生物降解中的變化對(duì)理解鹽環(huán)境中生物修復(fù)的過(guò)程、提高生物修復(fù)效率具有重要意義[13-16].本研究利用 PCRDGGE技術(shù)解析了1個(gè)BTEX降解菌群[17]在甲苯降解過(guò)程中的群落結(jié)構(gòu)變化,并測(cè)試了該菌群降解底物的多樣性,以期為高鹽環(huán)境中生物修復(fù)技術(shù)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 SSDMY培養(yǎng)基組分見(jiàn)文獻(xiàn)[18].

鹽度為5%的LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化鈉50g/L,用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4,121℃滅菌20min.

1.1.2 試劑與主要儀器 苯、甲苯、乙苯、二甲苯(北京現(xiàn)代精細(xì)化工,>99.5%),菲(Alfa Aesar, >98%).

氣相色譜儀(島津,GC-14B),高效液相色譜儀(島津,10Avp).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 降解實(shí)驗(yàn) 本研究中的菌群參見(jiàn)文獻(xiàn)[17].菌群降解BTEX的實(shí)驗(yàn):將甘油管冰上解凍,清洗菌體后接種至5%鹽度的LB培養(yǎng)基.30℃、150r/min避光過(guò)夜培養(yǎng),接種 1mL(OD600=0.8)至含 99mL SSDMY(0.01%酵母提取物)的 300mL錐形瓶(帶龍口塞,氣密性好)中,并向瓶中加入污染物[分別為苯、甲苯、苯和甲苯混合物(1:1)、BTEX(苯:甲苯:乙苯:二甲苯＝1:1:1:1),終濃度均為200mg/L],30℃、150r/min、避光馴化3d,接種,培養(yǎng)并檢測(cè)甲苯濃度.

菌群降解菲的實(shí)驗(yàn):10mL SSDMY(添加0.02%的酵母提取物)液體培養(yǎng)基,加入100μL菲-二甲基甲酰胺溶液(100g/mL)使得培養(yǎng)基中菲的終濃度為 100mg/L,接種菌液 250μL,30℃、150r/min、避光振蕩培養(yǎng),于第6d和第11d進(jìn)行檢測(cè).均設(shè)置滅活菌液作為空白對(duì)照.BTEX濃度測(cè)定采用頂空氣相色譜法[19].采用島津 GC-14B(Shimadzu)氣相色譜分析儀,分離柱為ΜLBON HR-1(0.25mm× 30m)毛細(xì)管柱,檢測(cè)器為FID氫火焰離子化檢測(cè)器.分析條件為:毛細(xì)管柱溫100℃,進(jìn)樣器溫度150℃,檢測(cè)器溫度150℃.測(cè)定結(jié)果為3個(gè)平行的均值.菲的測(cè)定方法如下:在培養(yǎng)瓶中加入50mL甲醇,超聲30min,充分萃取培養(yǎng)液及菌體表面的菲,0.45μm 濾膜過(guò)濾后,采用HPLC(島津10Avp)測(cè)定萃取液中菲濃度,進(jìn)樣量為20μL[20].HPLC條件:色譜柱為C18反相柱(依利特,Hypersil BDS C18,250mm×4.6mm×5μm),流動(dòng)相為甲醇:水(80:20),流速 1mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)254nm,柱溫40℃.測(cè)定結(jié)果為3個(gè)平行的均值.

1.2.2 群落結(jié)構(gòu)分析 細(xì)菌總 DNA的提取:分別在接種后的 24,36,48,60,72,96,120,144h收集1.5mL菌液.12000r/min離心,棄上清.采用細(xì)菌基因組小量提取試劑盒(博大泰克)提取總 DNA,取5μLDNA溶液1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

細(xì)菌 16S rRNA基因片段擴(kuò)增以細(xì)菌總DNA為模板,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增.采用目標(biāo)片段為16S rRNA基因 V6區(qū)的引物968f(GC夾板)和1401r[21]. PCR反應(yīng)體系和程序參見(jiàn)文獻(xiàn)[17].

DGGE電泳分析 采用 Bio-Rad公司DcodeTM基因突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分離.采用 16cm×16cm 8%聚丙烯酰胺凝膠,變性劑范圍為 40%～55% (7mol/L尿素和 40%去離子甲酰胺的混合物為100%變性劑).在1×TAE中,60℃,100V條件下電泳 12h,用 SYBR-Gold(1:000)避光染色 40min, ddH2O清洗后,轉(zhuǎn)移至UVP凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行DGGE凝膠圖像采集和分析.

16S rDNA測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建:目的條帶切膠回收后送交北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司測(cè)序.將測(cè)序結(jié)果提交 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)并登記獲得登錄號(hào).Blast搜索出相似性高的序列,利用Clustal軟件進(jìn)行多序列比對(duì),通過(guò)Mega3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 菌群對(duì)BTEX的降解

該菌群對(duì) BTEX的降解如表 1所示.在SSDMY(添加 0.02%酵母提取物)中,菌群對(duì)所列污染物(初始濃度為200mg/L)均能在80h內(nèi)完全降解.

表1 菌群對(duì)BTEX的降解Table 1 Biodegradation of BTEX by the consortium

考察了在SSDMY培養(yǎng)基(添加0.01%酵母提取物)中菌群對(duì)甲苯的降解情況,降解曲線如圖1所示.菌群在5d可完全降解200 mg/L甲苯.

圖1 菌群降解甲苯的降解曲線Fig.1 Biodegradation of toluene in SSDMY by the consortium

2.2 菌群群落結(jié)構(gòu)的解析及其在降解甲苯過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化

為考察解析菌群在降解甲苯過(guò)程中群落結(jié)構(gòu)的變化,分別在接種后的24,36,48,60,72,96,120, 144h收集菌體,并提取DNA進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析.對(duì)DGGE圖譜中較亮的16條優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行回收測(cè)序,獲得的序列提交GenBank注冊(cè)并獲得登陸號(hào)(FJ820238-FJ820253),利用 BLAST將所測(cè)得的序列與GenBank中已經(jīng)登錄的序列進(jìn)行同源性比對(duì),獲得數(shù)據(jù)庫(kù)中與該16條序列相似度高的序列,通過(guò)軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖2和表2.

圖2 5%鹽度下菌群群落結(jié)構(gòu)在甲苯降解過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamics analysis by DGGE of the consortium in SSDMY during toluene degradation

表2 菌群在5%鹽度下降解甲苯的DGGE圖譜對(duì)應(yīng)條帶的序列比對(duì)分析Table 2 Sequence analysis of bands retrieved from the 16S rDNA DGGE profile of the consortium in SSDMY during toluene degradation

根據(jù)序列比較的結(jié)果,除條帶 16外,其他條帶所含的DNA序列與GenBank中已知序列擁有較高的相似度(≥98%),其中條帶12與已知序列相似度達(dá) 100%.菌群各條帶所對(duì)應(yīng)的微生物主要集中在Thalassospira、Pseudomonas、Bacillus、Virgibacillus等屬,與條帶2和16相似的細(xì)菌種類為不可培養(yǎng)菌株.各個(gè)菌株來(lái)源于不同的環(huán)境,大都具有重要的生態(tài)功能.與條帶7和條帶10相似度均達(dá)到99%的是Pseudomonas stutzeri.該種的許多菌株具有降解芳烴的能力,如菌株OX1分別以苯、甲苯、二甲苯和二甲苯酚為唯一碳源和能源生長(zhǎng)[22];G11菌株在石油濃度為 1% (V/V)～ 2.5% (V/V)時(shí)降解率可達(dá)69%～59%[23];AN10和 P16分別可以降解萘和菲[24-25].與條帶12相似度達(dá)到100%的Virgibacillus sp.XQ-1是Liu等[26]分離得到的可以降解溴氰菊酯的菌株;與條帶14相似度達(dá)99%的是間苯二酚降解菌株Bacillus sp. QQDP517;與條帶15相似度達(dá)到99%的Bacillus sp. M15-5是苯并[a]芘降解菌群的組分.這些在甲苯降解過(guò)程中出現(xiàn)的主要條帶對(duì)應(yīng)的菌株大都具有明確的降解污染物的功能.其中與條帶 1相似度達(dá)99%的Thalassospira xiamenensis是Liu等[26]從廢油池中分離出的石油烴降解菌.其他條帶對(duì)應(yīng)的最大相似菌株,雖然沒(méi)有報(bào)道表明具有降解污染物的功能,但是大都來(lái)源于海洋和含鹽土壤,屬于嗜鹽細(xì)菌.

表3 菌群中的優(yōu)勢(shì)種屬隨甲苯加入的變化Table 3 Dominant bacteria in the consortium before and after adding toluene

由圖2和表3可見(jiàn),經(jīng)5%鹽度LB培養(yǎng)基活化后的菌群群落(泳道 LB)在甲苯馴化 3d以后(泳道0h),條帶4,5,8,9和11消失,條帶6亮度變淺,并出現(xiàn)條帶2,3,7,10和16.在加入甲苯前,菌群中的優(yōu)勢(shì)種主要為 Bacillus;加入甲苯馴化后菌群中開(kāi)始出現(xiàn) Thalassospira xiamenensis和Pseudomonas stutzer,這表明它們能夠耐受高濃度的甲苯,與甲苯的降解有關(guān);馴化時(shí)消失的Bacillus sp. hyss67、Bacillus aquimaris 12-4、Bacillus sp. 122004、Bacillus sp. 85-4和Bacillus aquaemaris TF-12,可能無(wú)法耐受甲苯.而在降解過(guò)程中,條帶1,2,3,7,10,12,14和15始終穩(wěn)定存在,表明 Thalassospira xiamenensis、Pseudomonas stutzeri、Virgibacillus、Bacillus在甲苯降解過(guò)程中起到重要作用.這一現(xiàn)象與上述種屬已知功能是相符的.其中,優(yōu)勢(shì)條帶7在降解過(guò)程中亮度不斷增強(qiáng)并在72h時(shí)達(dá)到最大(此時(shí)甲苯降解率達(dá)75%),此后 3d亮度有所下降,但是仍高于前 72h水平.另一條優(yōu)勢(shì)條帶 15,在降解過(guò)程中亮度沒(méi)有明顯的變化,表明該條帶對(duì)應(yīng)菌株在群落中的相對(duì)含量始終較為穩(wěn)定.鑒于條帶7,條帶15的優(yōu)勢(shì)地位,與它們相似度最高的 Pseudomonas stutzeri和Bacillus sp. M1 5-5在降解中可能起到了最為關(guān)鍵的作用.這一現(xiàn)象與這 2株菌已知的功能相符:與條帶 7相似度達(dá)到 99%的 Pseudomonas stutzeri 能降解多環(huán)芳烴,與條帶15相似度達(dá)到99%的Bacillus sp. M1 5-5是苯并[a]芘降解菌群的組分.盡管接種后120h已檢測(cè)不到甲苯存在,但主要條帶并未觀察到明顯的亮度下降,表明菌群中的優(yōu)勢(shì)菌株在降解結(jié)束后并不會(huì)立刻進(jìn)入衰亡期,其優(yōu)勢(shì)狀態(tài)還會(huì)持續(xù).

2.3 菌群對(duì)多環(huán)芳烴的降解

在培養(yǎng)基中添加 0.02%酵母提取物時(shí),菲在第11d的降解率為47.96%(圖4).這一現(xiàn)象與對(duì)菌群的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果是一致的:與條帶1相似度達(dá)99%的Thalassospira xiamenensis是石油烴降解菌;與條帶 7相似度達(dá)到 99%的 Pseudomonas stutzeri 是多環(huán)芳烴降解菌;與條帶15相似度達(dá)到99%的Bacillus sp. M1 5-5是苯并[a]芘降解菌群的組分.這一結(jié)果顯示了該菌群降解底物的多樣性,在實(shí)際生物修復(fù)中具有良好的應(yīng)用前景.

圖3 菌群對(duì)菲的降解Fig.3 Biodegradation of phenanthrene by the corsortium

3 結(jié)論

3.1 菌群在5%鹽度下可以完全降解苯、甲苯、苯和甲苯混合物(1:1)、BTEX(苯:甲苯:乙苯:二甲苯＝1:1:1:1). 另外,該菌群可以降解菲,11d的降解率為47.96%.

3.2 在以甲苯為底物培養(yǎng)時(shí),菌群群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,優(yōu)勢(shì)種屬由Bacillus sp.和Bacillus aquimaris轉(zhuǎn)變?yōu)?Thalassospira xiamenensis、Pseudomonas stutzeri、Virgibacillus sp.和Bacillus sp..

3.3 在 5%鹽度下,Thalassospira xiamenensis、Pseudomonas stutzeri、Virgibacillus和 Bacillus在甲苯降解過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)種屬.在整個(gè)過(guò)程中,菌群群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,并在降解完成后 24h內(nèi)沒(méi)有衰亡的跡象.

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Analysis of bacterial community structure in toluene degradation by a halophilic consortium.

JIANG Jing1, WANG Hui1*, ZHANG Li-hua2, MAO Xin-wei1, YAN Hai2
(1.State Key Joint Laboratory on Environmental Simulation and Pollution Control, Department of Environmental Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China；2.College of Applied Science, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China). China Environmental Science, 2010,30(2)：216～221

X172

A

1000-6923(2010)02-0216-06

2009-04-07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30970098,2073001);國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)基金課題(09Y03ESPCT)

* 責(zé)任作者, 副教授, wanghui@mail.tsinghua.edu.cn

蔣 婧(1984-),女,湖北武漢人,清華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物研究.