198例胃癌手術(shù)標(biāo)本Her-2蛋白表達與臨床病理的相關(guān)性和靶向治療

奚文崎 張本炎 金曉龍 楊衛(wèi)平 燕敏 王建承

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腫瘤科，*病理科，▲普外科，上海 200025

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率在常見腫瘤中排名第4位［1］，居目前腫瘤死亡的第2位［2］。20世紀(jì)90年代以后，化療新藥和新輔助治療方案的運用使胃癌術(shù)后患者的生存率有所改善(30%～50%)，但總體療效仍很差，生存獲益有限(＜10%)［3］。因此，胃癌研究依然是癌癥研究中的重點。胃癌的發(fā)生和發(fā)展，癌細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移與多個基因的異常有關(guān)。近年來國內(nèi)外針對不同的基因異常和細(xì)胞通路開展了多個靶向治療。其中最引人矚目的是2009年ASCO會議上公布的TOGA臨床試驗初步結(jié)果，結(jié)果顯示，曲妥珠單抗聯(lián)合化療組的總生存期(overall survival，OS)較單純化療組顯著延長2.4個月(13.5個月 vs 11.1個月，HR=0.74，95%CI：0.60～0.91，P=0.004 8)，死亡率降低26%，確立了曲妥珠單抗在胃癌治療中的地位［4］。曲妥珠單抗通過抑制Her-2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，阻斷Her-2受體細(xì)胞外區(qū)域分裂和激活抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用來抑制腫瘤生長。

Her-2基因定位于人17號染色體(17q21-22)，毗鄰于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱa基因旁［5-6］。已在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和結(jié)腸癌的細(xì)胞中檢測到Her-2基因擴增或蛋白過表達。在乳腺癌研究中已經(jīng)證實有15%～25%的病例發(fā)生Her-2基因的擴增和Her-2蛋白的過表達，這類患者往往是腫瘤惡性程度高、進展迅速的病例，且化療緩解期短，對標(biāo)準(zhǔn)化療和內(nèi)分泌治療易產(chǎn)生耐藥，患者的無病生存和總生存期縮短［7］。因此，在乳腺癌中Her-2已是一個非常有價值的預(yù)測化療和內(nèi)分泌治療反應(yīng)率的指標(biāo)［8］。

目前，對惡性腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)［4］：Her-2的過表達與多種實體瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。至今國內(nèi)大樣本研究Her-2在胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移中作用的報道較少，本研究擬用免疫組化方法，檢測由198例胃癌病例構(gòu)建的組織芯片中Her-2蛋白的表達，就其表達狀況與臨床病理學(xué)指標(biāo)、生存期的相關(guān)性進行統(tǒng)計學(xué)分析，探討Her-2與胃癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后之間的相互關(guān)系，為胃癌的個體化治療提供基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選取2002年1月—2005年4月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院行胃癌外科手術(shù)的病理標(biāo)本260例。所有患者術(shù)后每年隨訪2次，本研究隨訪工作截止于2010年3月。最長隨訪時間為98個月，最短隨訪時間為69個月，隨訪資料完整病例共198例。所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)取材，石蠟包埋，并經(jīng)HE染色確診。按照2003年WHO消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)中胃癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)將進展期胃癌分為腺癌、乳頭狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌和印戒細(xì)胞癌等。根據(jù)Lauren胃癌分型將胃癌分為腸型(intestinal type)和彌漫型胃癌(diffuse type)兩類［9］。采用AJCC第6版的分類方法進行TNM分期評估和臨床分期評估［10］。

1.2 組織芯片的構(gòu)建

采用組織芯片(tissue microarray，TMA)制作儀(上海芯超公司制作)，每例癌組織選2點，另選其中89例正常胃黏膜1點作對照組。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用Ventana全自動免疫組織化學(xué)儀(Bench Marker)進行免疫組織化學(xué)染色。實驗按產(chǎn)品說明書操作。選擇Her-2蛋白表達陽性(+++)和陰性的乳腺浸潤性癌分別作為陽性和陰性對照組。正常胃黏膜上皮表達情況作正常對照。步驟：⑴脫蠟5 min×5次；⑵抗原修復(fù)，pH=6.0，37 ℃，30 min；⑶滴加一抗，37 ℃，32 min；⑷滴加二抗，37 ℃，30 min；⑸DAB顯色8 min；⑹蘇木精復(fù)染細(xì)胞核；⑺常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。一抗：Her-2為即用型鼠抗人Her-2單抗，克隆號4B5 (美國羅氏公司生產(chǎn))。

1.4 Her-2免疫組織化學(xué)標(biāo)記評判標(biāo)準(zhǔn)

Her-2定位于細(xì)胞膜。強度標(biāo)準(zhǔn)采用Hofmann評判法［8］：免疫組織化學(xué)陰性(0)：不染色或<10%的細(xì)胞膜染色；免疫組織化學(xué)陰性(1＋)：>10%的細(xì)胞膜染色較淺或僅有部分膜染色；免疫組織化學(xué)可疑(2＋)：>10%的細(xì)胞膜或外膜輕到中度染色；免疫組織化學(xué)(3＋)：細(xì)胞膜360°強染色或U字形強染色的癌細(xì)胞數(shù)量>10%。

1.5 統(tǒng)計處理

檢測數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行，計數(shù)資料的分析采用χ2檢驗，使用Kaplan-Meier方法估計生存率，Log-Rank檢驗方法分析生存率的差異，逐步Cox回歸分析篩選生存率的影響因素，進入和剔除方程標(biāo)準(zhǔn)皆為0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

構(gòu)建組織芯片的198例胃癌中男性147例，女性51例，男女比例為2.9∶1。中位年齡66.5歲(31～85歲)，其中61例患者＜60歲，127例患者≥60歲。所有患者術(shù)前均經(jīng)胃鏡活檢病理學(xué)證實為原發(fā)性胃癌。其中手術(shù)方式以D2根治術(shù)者149例，姑息性切除術(shù)者24例；腫瘤位于食管胃連接部者49例，胃竇體部者149例；腫瘤最大直徑≤5 cm 111例，>5 cm87例；病理類型以Lauren’s分型為標(biāo)準(zhǔn)，其中腸型者169例、彌漫型29例。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移12例；切緣陽性8例；腫瘤侵犯神經(jīng)15例、腫瘤侵犯脈管28例、腫瘤侵犯淋巴管4例、腫瘤侵犯食道8例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期61例(其中Ⅰ期31例，Ⅱ期30例)、Ⅲ～Ⅳ期 137例(其中Ⅲ期95例，Ⅳ期42例)；術(shù)后死亡92例，存活106例，5年總生存率為53.6%，其中腸型胃癌患者5年生存率為58%，彌漫型胃癌患者為36%。

2.2 免疫組化標(biāo)記結(jié)果

圖1 胃癌組織與正常胃黏膜Her-2免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果Fig.1 Immunohistochemical staining of gastric carcinomas and normal mucosa with Her-2 antibody(DAB,×100)

在198例胃癌中，Her-2 免疫組織化學(xué)標(biāo)記(0)者82例、免疫組織化學(xué)標(biāo)記(1+)者52例、免疫組織化學(xué)標(biāo)記可疑(2+)者36例、免疫組織化學(xué)標(biāo)記(3+)者29例，其中免疫組織化學(xué)標(biāo)記(3＋)和免疫組織化學(xué)標(biāo)記可疑(2+)者共65例，Her-2陽性表達率達32.8%。正常胃黏膜中不表達Her-2(圖1)。

2.3 Her-2表達與臨床病理學(xué)特點的相關(guān)性

Her-2的表達與Lauren分型相關(guān)，Her-2在腸型胃癌中表達率為36.7%，在彌漫型胃癌中表達率僅為10.4%。Her-2過表達與腫瘤大小、Lauren分型、浸潤深度和臨床分期相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、手術(shù)切除方式、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯神經(jīng)、侵犯脈管、侵犯淋巴管及侵犯食管無關(guān)(表1)。

2.4 Her-2與生存期分析

在胃癌組織中Her-2陽性表達組的生存率與Her-2陰性表達組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 Her-2蛋白表達陽性組胃癌與陰性組胃癌患者的5年生存率比較Fig.2 Comparison 5-year survival rate of Her-2 positive GC patients with Her-2 negative GC patients

表1 胃癌組織中Her-2蛋白表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation between Her-2 protein expression and clinicopathologic parameters(n)

2.5 逐步多因素Cox回歸分析

逐步Cox回歸分析結(jié)果表明手術(shù)切除方式(P<0.002)、組織病理學(xué)類型(P<0.032)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目(P<0.003)、侵犯淋巴管(P<0.003)、TMN分期(P=0.000)與胃癌術(shù)后患者長期生存相關(guān)，而在本研究中性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、侵犯血管或神經(jīng)、切緣陽性、侵犯食道，Her-2過表達間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與患者的遠(yuǎn)期生存無關(guān)(表2)。

3 討 論

1986年Sakai等［11］率先報道采用免疫組化方法在胃癌中檢測出Her-2蛋白過表達。20世紀(jì)90年代，文獻報道胃癌中運用多克隆抗體檢測Her-2蛋白表達率為9%～38%［12-14］。近年來Tanner等［15］報道在食道腺癌中Her-2過表達率為24%。但是，Her-2基因擴增或蛋白過表達的臨床意義尚不明確。不同組胃癌研究中Her-2基因擴增或蛋白過表達的結(jié)論不一致。Her-2陽性率從最低6%到最高43%不等［16-17］。造成如此大差異的原因很多：可能是研究組的胃癌患者組成不同，西方組以胃上部癌為主，而亞洲組則以中下部胃癌為主；也可能與免疫組化檢測Her-2抗體的不同有關(guān)，都會影響Her-2的檢出率。胃癌的異質(zhì)性明顯高于乳腺癌，其成為影響Her-2檢出率的非常重要的因素。 此外，缺乏對胃癌中Her-2 表達結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)也是重要原因之一。本實驗采用Hofmann評分法進行Her-2陽性表達評分。對于Her-2可用FISH雙色熒光原位雜交技術(shù)檢測Her-2基因狀況，也可用IHC檢測Her-2蛋白，F(xiàn)ISH方法敏感性強，被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)。但是要注意，基因擴增并不意味著蛋白過表達，因為翻譯和轉(zhuǎn)錄也參與調(diào)節(jié)蛋白的合成。正常細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的翻譯效率并不相同，已有文獻證實，少數(shù)乳腺癌和胃癌細(xì)胞Her-2蛋白高表達卻沒有基因擴增。此外，由于胃癌腫瘤存在異質(zhì)性，免疫組織化學(xué)標(biāo)記能在明視野下觀察形態(tài)，更能準(zhǔn)確檢測到腫瘤組織內(nèi)局部Her-2蛋白的陽性表達情況［4］。

表2 198例胃癌患者臨床病理參數(shù)的Cox多因素逐步回歸分析Tab.2 Multiple step-wise logistic Cox analysis of clinicopathologic parameters in 198 cases with gastric carcinoma

自1990年起有不少學(xué)者開始研究Her-2表達與腸型胃癌的相關(guān)性。最近有幾項研究也已證實Her-2在腸型胃癌中高表達。本研究結(jié)果顯示Her-2在腸型胃癌中表達高于彌漫型胃癌(36.7% vs 10.3%，P=0.005)，與Gravalos等［18］及其他學(xué)者報道相似［19-20］。 本組研究與2009年ACSO會議上報道的TOGA試驗［4］結(jié)果比較(32% vs 6.1%，P<0.001)基本相似。本研究略有升高，提示在我國胃癌病例的組成中腸型胃癌的比例比歐洲更高。Kang等［19］報道Her-2基因擴增與腫瘤位置有關(guān)，而且腸型胃癌的表達率高于彌漫型胃癌。而本研究中發(fā)現(xiàn)Her-2表達與腫瘤部位無關(guān)。全球胃癌發(fā)病的流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)歐美國家以食管胃連接部腫瘤常見［14,17,21］，而亞洲包括日本和我國胃癌患者的發(fā)病部位以胃竇體部為多見，食管胃連接部腫瘤相對較少。這種區(qū)別反映了東西方胃癌患者的發(fā)病機制不同。

關(guān)于Her-2是否能作為胃癌的主要預(yù)測因子的觀點爭議較多，因為各組研究結(jié)果不一［18,20］。Tanner等［15］報道，采用色素原位雜交(CISH)檢測131例胃癌患者中Her-2的總基因擴增率為12%，其中在100例賁門癌患者中，Her-2基因擴增率為24%。Her-2基因擴增與生存期縮短顯著有關(guān)(P=0.0089)，Her-2陰性患者的生存期(12.7個月)較Her-2陽性患者(6.6個月)的生存期延長2倍，但差異卻無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可能是因為樣本數(shù)較少。最近Park等［22］報道， Her-2過表達提示中位生存期縮短(922 d vs 3 243 d)，5年生存率降低(21% vs 63%，P<0.05)。 Vizoso等［23］報道Her-2高表達胃癌患者的無病生存期和生存期相對更短。而Garcia等［24］得出相反的結(jié)論，認(rèn)為Her-2水平與胃癌患者的臨床病理特性無明顯關(guān)系。張杰等［25］認(rèn)為Her-2基因擴增或過表達與胃旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。Pinto-de-sousa等［26］報道，Her-2過表達的5年生存率明顯低于Her-2正常患者(16.2% vs 43.7%)，經(jīng)多變量分析發(fā)現(xiàn)，Her-2過表達與靜脈侵犯的胃癌和賁門、胃體、胃底部癌的5年生存率影響不顯著，但對無靜脈侵犯的胃癌和胃竇部胃癌的5年生存率則有影響。

本研究顯示Her-2表達與腫瘤大小、Lauren分型、浸潤深度和TNM分期有關(guān)(P<0.05)，臨床分期越晚，腫瘤越大，則Her-2表達率越高；但Her-2高表達胃癌患者的5年生存率并未明顯縮短(P>0.05)。分析入組病例，本研究發(fā)現(xiàn)大部分胃癌病例分期在Ⅱ期以上及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者均接受了術(shù)后輔助化療, 可能影響統(tǒng)計分析。2009年NCCN建議Ⅲ期以上患者和Ⅱ期高?；颊咝杞邮苄g(shù)后輔助化療，這些患者均能從術(shù)后輔助化療中獲益。2009年ASC0會議上發(fā)表的TOGA試驗摘要顯示在晚期胃癌中單純化療組的OS也達11.1個月，化療能延長患者的生存期的結(jié)論已經(jīng)被證實，由此推測術(shù)后輔助化療可能影響到Her-2表達與胃癌生存率。本研究中胃癌患者Her-2免疫組化檢測結(jié)果顯示Her-2陽性患者(+++)28例(14.14%)，這些患者可根據(jù)具體情況進入赫賽汀輔助治療的臨床研究。而Her-2(++)患者37例(18.69%)，可采用FISH技術(shù)檢測Her-2基因情況，以明確是否為Her-2陽性胃癌。對于晚期不能手術(shù)的胃癌患者，應(yīng)采取因人而異的個體化治療策略。TOGA研究結(jié)果表明經(jīng)Her-2標(biāo)準(zhǔn)化的Hofmann檢測流程進行分層［8］，對免疫組織化學(xué)標(biāo)記Her-2蛋白表達+++，或Her-2表達++，經(jīng)FISH檢測Her-2基因有擴增的胃癌患者可用化療加赫賽汀的治療方案。癌癥是多基因、多步驟的發(fā)生發(fā)展過程。胃癌的生物學(xué)是由多種不同機制共同作用的結(jié)果，Her-2信號通路的異常僅僅是其中一個方面。本研究結(jié)果表明Her-2與腫瘤浸潤深度和臨床分期密切相關(guān)，但與生存期無明顯關(guān)系。我們將進一步進行Her-2基因檢測，為胃癌的靶向治療提供數(shù)據(jù)。

［1］ Muhammad WS, Nianwen S, Susan Z.Capecitabine treatment patterns in patients with gastroesophageal cancer in the United States［J］.World J Gastroenterol, 2009, 15(35): 4415-4422.

［2］ Kelley JR, Duggan JM.Gastric cancer epidemiology and risk factors［J］.J Clin Epidemiol, 2003, 56: 1-9.

［3］ 許曉勇, 胡乃中, 石海, 等.222例早期胃癌的臨床病理及預(yù)后分析［J］.中華消化內(nèi)鏡雜志, 2009, 26(4): 203-205.

［4］ Van Cutsem E, Kang Y, Chung H, et al.Efficacy results from the ToGA trial: A phrase Ⅲ study of trastuzumab added to standard chemotherapy(CT) in first-line human epidermal growth factor receptor 2(Her-2)-positive advanced gastric cancer(GC)［J］.J Clin Oncol, 2009, 27(18S): abstr LBA4509.

［5］ Akiyama T, Sudo C, Ogawara H, et al.The product of the human c-erbB-2 gene: A 185-kilo-Dalton glycoprotein with tyrosine kinase activity［J］.Science, 1986, 232: 1644-1646.

［6］ Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, et al.Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene［J］.Science, 1985,230: 1132-1139.

［7］ 馮瑩瑩, 徐建明.Herceptin治療Her-2/neu過表達胃癌的研究進展［J］.中國腫瘤臨床與康復(fù), 2007, 14(2): 177-180.

［8］ Hoffmann M, Stoss O, Shi D, et al.Assessment of a Her-2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study［J］.Histopathology 2008, 52: 797-805.

［9］ 武忠弼.病理學(xué)［M］.3版.北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1994:286.

［10］ 格林尼 FL, 佩董 DL, 弗萊明 ID, 等.AJCC癌癥分期手冊［M］.毛偉征, 蘇冬明, 李雪萍, 等譯.6版.沈陽: 遼寧科學(xué)技術(shù)出版社, 2005: 99-103.

［11］ Sakai K, Mori S, Kawamoto T, et al.Expression of epidermal growth factor receptors on normal human gastric epithelia and gastric carcinomas［J］.J Natl Cancer Inst, 1986, 77: 1047-1052.

［12］ Yonemura Y, Ninomiya I, Yamaguchi A, et al.Evaluation of immunoreactivity for erbB-2 protein as a marker of poor short-term prognosis in gastric cancer［J］.Cancer Res,1991, 51: 1034-1038.

［13］ Ishida T, Tsujisaki M, Hanzawa Y, et al.Significance of erbB-2 gene product as a target molecule for cancer therapy［J］.Scand J Immunol, 1994, 39: 459-466.

［14］ Tokunaga A, Onda M, Okuda T, et al.Clinical significance of epidermal growth factor(EGF), EGF receptor and c-erbB-2 in human gastric cancer［J］.Cancer, 1995, 75: 1418-1425.

［15］ Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, et al.Amplification of Her-2 in gastric carcinoma: association with topoisomeraseⅡa gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab［J］.Ann Oncol, 2005, 16: 273-278.

［16］ Yano T, Ochiai A, Doi T, et al.Expression of Her-2 in gastric cancer: comparison between protein expression and gene amplification using a new commercial kit［J］.J Clin Oncol,2004, 22(14S): Abstr 4053.

［17］ Gravalos C, Ma′ rquez A, Garc?′a-Carbonero R, et al.Correlation between Her-2/neu overexpression/amplification and clinicopathological parameters in advanced gastric cancer patients: a prospective study［C］.Gastrointestinal Cancers Symposium, 2007, 130: Abstr 89.

［18］ Gravalos C, Jimeno A.Her-2 in gastric cancer: a new prognostic factor and a novel therapeutic target［J］.Ann Oncol, 2008, 19: 1523-1529.

［19］ Kang Y, Bang Y, Lordick F, et al.Incidence of gastric and gastro-esophageal cancer in the ToGA trial: correlation with Her-2 positivity［C］.Gastrointestinal Cancer Symp, 2008,75: Abstr 11.

［20］ Berx G, Becker KF, Hofler H, et al.Mutations of the human E-cadherin(CDH1) gene［J］.Hum Mutat, 1998, 12: 226-237.

［21］ Sasano H, Date F, Imatani A, et al.Double immunostaining for c-erbB-2 and p53 in human stomach cancer cells［J］.Hum Pathol, 1993, 24: 584-589.

［22］ Park DI, Yun JW, Park JH, et al.Her-2/neu amplification is an independent prognostic factor in gastric cancer［J］.Dig Dis Sci, 2006, 51: 1371-1379.

［23］ Vizoso FJ, Corte MD, Alvarez A, et al.Membranous levels of cerbB-2 oncoprotein in gastric cancer: their relationship with clinicopathological parameters and their prognostic significance［J］.J Biol Markers, 2003, 19(4): 268-274.

［24］ Garcia I, Vizoso F, Martin A, et al.Clinical significance of the epidermal growth factor receptor and Her-2 receptor in respectable gastric cancer［J］.Ann Surg Oncol, 10(3): 234-241.

［25］ 張杰, 舒維清, 朱為, 等.胃癌中Her-2/neu過表達與基因擴增及其意義［J］.中華病理學(xué)雜志, 2003, 132(1): 52-53.

［26］ Pinto-de-sousa JD, Almeida R.CerbB-2 expression in associated with tumor location and venous invasion and influences survival of patients with gastric carcinoma［J］.Int J Surg Pothol, 2002, 10(4): 247-256.