PIM1表達(dá)與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后的關(guān)系

田榮華 應(yīng)韶旭 李曉 黃華

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第六人民醫(yī)院血液科，上海 200233；2.南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院血液科，江蘇 南通 226600；3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，江蘇 南通 226000

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）中最普通的一種類(lèi)型，大約占新診斷患者的30%～40%，是一種具有侵襲性、生長(zhǎng)迅速并具有臨床異質(zhì)性的中-高度惡性淋巴瘤［1］?；颊叩念A(yù)后當(dāng)前主要依靠5個(gè)簡(jiǎn)單的臨床變量組成的國(guó)際預(yù)后指數(shù)（inter-national prognostic index，IPI），但其中沒(méi)有一個(gè)與淋巴瘤生物學(xué)相關(guān)的變量［2］。到目前為止也沒(méi)有一個(gè)與淋巴瘤生物學(xué)相關(guān)的預(yù)后標(biāo)志得到公認(rèn)。cDNA和寡核苷酸微陣列的基因表達(dá)經(jīng)常用來(lái)篩選患者的預(yù)后因子［3］，但是這個(gè)技術(shù)費(fèi)用昂貴且臨床應(yīng)用不方便，因此免疫組化方法經(jīng)常被用來(lái)檢測(cè)與預(yù)后相關(guān)基因的蛋白水平。

Pim1基因最早是作為莫洛尼小鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MoMuLV）的前病毒插入點(diǎn)而被發(fā)現(xiàn)的，它可以促進(jìn)小鼠的淋巴瘤的形成［4］。Pim1作為一種原癌基因，在調(diào)控細(xì)胞凋亡、分化、增殖以及腫瘤形成等方面發(fā)揮了非常重要的作用［5］。有研究顯示：Pim1基因由于體細(xì)胞高頻突變而導(dǎo)致其高表達(dá)，也有研究表明是染色體異位導(dǎo)致其高表達(dá)［6-7］，但其與預(yù)后的關(guān)系目前仍不能確定。因此，我們的研究目的是通過(guò)免疫組化的方法評(píng)價(jià)PIM1蛋白的表達(dá)與DLBCL預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 資料 收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第六人民醫(yī)院和南通大學(xué)附屬醫(yī)院2002年1月—2006年2月確診的初發(fā)淋巴結(jié)起源的DLBCL患者53例進(jìn)行回顧性分析，其中18例患者來(lái)自前者，35例患者來(lái)自后者。本實(shí)驗(yàn)之前所有患者的病理切片均請(qǐng)2位病理科醫(yī)生復(fù)核過(guò)。所有病例都接受了6～8個(gè)周期的CHOP方案化療，15例患者在化療后淋巴結(jié)消退不滿(mǎn)意的情況下接受了放療，但病例均未接受利妥昔單抗治療，不適合的病例均未入選。53例患者中，男性患者29例，女性患者24例，患者平均年齡55歲（范圍12～79歲），平均隨訪(fǎng)時(shí)間32個(gè)月（1～86個(gè)月）。對(duì)53例患者進(jìn)行了Ann Arbor臨床分期，其中Ⅰ/Ⅱ期27例，Ⅲ/Ⅳ期26例。與預(yù)后相關(guān)的IPI取決于年齡、體能狀況、血清乳酸脫氫酶水平（lactate dehydrogenase，LDH）、結(jié)外病變的數(shù)量、疾病分期這5個(gè)臨床變量［2］。根據(jù)IPI評(píng)分分為低危（0～2分）25例和高危（3～5分）28例，患者的具體資料見(jiàn)表1。

1.2 主要試劑 一抗兔抗人PIM1單克隆抗體為Epitomics，為Inc公司產(chǎn)品，一抗兔抗人CD10、BCL6、MUM1單克隆抗體為Dako公司產(chǎn)品，二抗EnVisionTM系統(tǒng)為Dako公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 免疫組織化學(xué)EnVision通用型二步法，步驟如下：⑴切片烘片；⑵二甲苯脫蠟；⑶乙醇溶液逐級(jí)水化；⑷3%的過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；⑸抗原微波修復(fù)；⑹滴加合適的一抗，置切片于濕盒內(nèi)，室溫靜置45 min；⑺滴加EnVision二抗一酶標(biāo)多聚物，37 ℃放置30 min；⑻滴加0.04%DAB顯色液。PIM1、CD10、BCL6和MUM1抗體工作液稀釋度為l∶100。以反應(yīng)性增生的扁桃體作為對(duì)照，PIM1抗體著色于扁桃體的上皮和血管內(nèi)皮及生發(fā)中心的幼稚細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，而濾泡周?chē)某墒斓男×馨图?xì)胞不著色作為陰性對(duì)照（圖1）。

表1 PIM的表達(dá)及患者的臨床特征Tab.1 PIM1 and characteristics of patients with DLBCL

1.4 結(jié)果判斷 PIM1抗體著色于細(xì)胞核視為陽(yáng)性，免疫組化結(jié)果以500個(gè)淋巴瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)陽(yáng)性比，陽(yáng)性病例是指抗體著色≥30%的淋巴瘤細(xì)胞。生發(fā)中心和非生發(fā)中心以CD10、BCL6、MUM1三個(gè)抗體區(qū)分，具體標(biāo)準(zhǔn)按照Hans等［8］的方法。若切片著色不均，以陽(yáng)性細(xì)胞比例較高區(qū)域進(jìn)行分析，以上結(jié)果由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第六人民醫(yī)院病理科和南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科醫(yī)生在雙盲情況下觀(guān)察所得。比較臨床參數(shù)和PIM1的表達(dá)時(shí)，我們把這個(gè)PIM1的持續(xù)性變量轉(zhuǎn)換為二分類(lèi)變量，≥30%的腫瘤細(xì)胞著色定義為高表達(dá)，<30%的腫瘤細(xì)胞著色定義為低表達(dá)［9］。

1.5 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 客觀(guān)療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)按我國(guó)實(shí)體瘤客觀(guān)近期療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)［10］。

1.6 隨訪(fǎng) 所有入選病例臨床資料均齊全并可以電話(huà)隨訪(fǎng)，對(duì)全部病例以電話(huà)形式進(jìn)行追訪(fǎng)，所有患者隨訪(fǎng)至2009年8月，電話(huà)隨訪(fǎng)的內(nèi)容包括患者一般狀況，以前治療的情況，近期復(fù)查情況。隨訪(fǎng)期內(nèi)28例患者死亡，13例患者一直處于緩解中。生存期為病理確診之日至死亡或最后隨訪(fǎng)時(shí)間。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理 SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，分類(lèi)變量用Fisher’s檢驗(yàn)，數(shù)值變量用Mann-Whitney檢驗(yàn)，生存曲線(xiàn)用Kaplan-Meier分析和比較用Log-rank法，Logistic回歸和Cox回歸模型分析用于評(píng)價(jià)pim1和IPI對(duì)總生存和化療緩解率的影響。所有的檢驗(yàn)以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？偵妫╫verall survival，OS）指從確診到死亡或上次接觸（指沒(méi)有死亡的病例上次電話(huà)隨訪(fǎng)的時(shí)間）之間的時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1 PIM1在DLBCL中的表達(dá) PIM1著色于細(xì)胞核，腫瘤細(xì)胞著色比例為0%～100%，平均值為30%。在我們的實(shí)驗(yàn)中，所有病例細(xì)胞核均著色，在24例（45.2%）PIM1高表達(dá)患者中，有5例合并細(xì)胞質(zhì)著色（圖1）。PIM1高表達(dá)在年齡、性別、LDH水平、分期、B癥狀之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在其他方面存在差異（P<0.05，表1）。

2.2 PIM1的表達(dá)與生發(fā)中心表型 根據(jù)生發(fā)中心的標(biāo)志，有25例是生發(fā)中心起源，其余是非生發(fā)中心起源，PIM1的高表達(dá)在生發(fā)中心起源的淋巴瘤和非生發(fā)中心起源的淋巴瘤兩組之間存在差異（P=0.005）。

2.3 PIM1的表達(dá)與化療的完全緩解率 所有53例患者全部接受了6～8個(gè)周期的CHOP方案化療，均可評(píng)估化療的反應(yīng)性。27例（50.9%）患者獲得了完全緩解，但其中有14例（51.9%）患者在隨訪(fǎng)期內(nèi)復(fù)發(fā)，其余13例患者在隨訪(fǎng)期末一直處于完全緩解中。部分緩解和沒(méi)有緩解的患者分別是19例（35.8%）和7例（13.3%）。PIM1高表達(dá)的患者的完全緩解率為29.2%，PIM1低表達(dá)的患者的完全緩解率為68.9%（P=0.006）。沒(méi)有完全緩解的患者比完全緩解的患者具有更高的PIM1的表達(dá)（65.4% vs 25.9%），PIM1的表達(dá)與復(fù)發(fā)沒(méi)有關(guān)系。我們對(duì)PIM1的表達(dá)和IPI分期進(jìn)行了Logistic回歸分析。在單因素回歸中顯示PIM1高表達(dá)的完全緩解率的OR=0.263（95%CI：0.084～0.825，P=0.022），高IPI組OR=0.184（95%CI：0.057～0.559，P=0.005）；在包括PIM1和IPI的多因素回歸中，PIM1高表達(dá)的完全緩解率的OR=0.374（95%CI：0.110～1.278，P=0.117），高IPI組OR=0.235（95%CI：0.069～0.801，P=0.021）。

2.4 PIM1的表達(dá)與患者的總生存 在隨訪(fǎng)期內(nèi)28例患者死亡，平均生存時(shí)間14個(gè)月（1～30個(gè)月），3年的總生存率為47.2%。Kaplan-Meier分析顯示：PIM1高表達(dá)組3年總生存率為29.2%，PIM1低表達(dá)組為62.1%；高IPI組3年總生存率為25.0%，低IPI組為72.0%（圖2）。PIM1高表達(dá)組3年總生存率比PIM1低表達(dá)組低（P<0.001），在高IPI組和低IPI組間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。單因素COX回歸分析表明，PIM1高表達(dá)組RR=3.755（95%CI：1.684～8.375，P<0.001）；IPI的RR=3.978（95%CI：1.681～9.413，P=0.002）。在包括PIM1和IPI的多因素Cox回歸分析表明，PIM1高表達(dá)組RR=2.756（95%CI：1.197～6.347，P=0.017）；高IPI組RR=2.947（95%CI：1.203～7.219，P=0.018）。

3 討 論

在本研究中，我們檢測(cè)了PIM1在一組原發(fā)性結(jié)節(jié)性DLBCL中的表達(dá)，PIM1高表達(dá)的患者生存期更短、化療緩解率較低。雖然PIM1的表達(dá)也與其他一些與預(yù)后相關(guān)的因素有關(guān)，如生發(fā)中心表型和IPI，但是多因素分析顯示，PIM1的表達(dá)與IPI不相關(guān)。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PIM1高表達(dá)是DLBCL的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后不良標(biāo)志。

在我們的研究中，PIM1的高表達(dá)在單因素回歸分析中是化療完全緩解率的負(fù)性預(yù)后標(biāo)志，但在PIM1和IPI多因素分析中并沒(méi)有意義。我們通過(guò)共線(xiàn)性診斷沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PIM1和IPI之間存在共線(xiàn)性（VIF=1.121，TOL=0.892），因此我們得出多因素回歸中沒(méi)有意義，可能是與我們的樣本量小有關(guān)。我們推斷PIM1的高表達(dá)與化療的完全緩解率可能相關(guān)，但需要更大樣本含量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)我們的推斷。

據(jù)我們所知，本實(shí)驗(yàn)是第一次檢測(cè)PIM1的表達(dá)與DLBCL預(yù)后的關(guān)系。雖然基因表達(dá)研究顯示：Pim1在某些DLBCL的亞群中與預(yù)后相關(guān)，但是關(guān)于PIM1蛋白與DLBCL的預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。Pasqualucci等［6］研究發(fā)現(xiàn)：Pim1是體細(xì)胞高頻突變的靶點(diǎn)，在50%的非免疫缺陷的DLBCL中可以檢測(cè)到Pim1基因突變。Akasaka等［7］研究表明：染色體異位導(dǎo)致PIM1的高表達(dá)，在一些大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生中可能起著重要的作用。Sivertsen等［11］和Hoefnagel等［12］在基因水平的研究顯示：一些亞型的大B細(xì)胞淋巴瘤和皮膚起源的DLBCL中，PIM1的高表達(dá)可能與患者預(yù)后相關(guān)，且PIM1的高表達(dá)與非生發(fā)中心起源的淋巴瘤相關(guān)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，24例PIM1高表達(dá)的患者有18例屬于非生發(fā)中心起源（r=0.404，P=0.003），證實(shí)了他們的相關(guān)研究結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)PIM1高表達(dá)在單因素和多因素Cox分析均顯示是總生存的獨(dú)立的預(yù)后因素。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果從PIM1蛋白水平證實(shí)了上面這些Pim1基因水平的研究結(jié)果。

PIM1蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以磷酸化許多底物導(dǎo)致相應(yīng)的生物學(xué)功能，主要涉及細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、促進(jìn)生存抑制凋亡，因此在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用［13］。雖然Pim1促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制沒(méi)有完全闡明，但一些研究顯示它有促進(jìn)細(xì)胞生存的作用［13-14］。最近研究發(fā)現(xiàn)的Pim1的底物Bad，是一種促凋亡蛋白，PIM1可以磷酸化Bad的112位的絲氨酸，而該位點(diǎn)是Bad失活的控制點(diǎn)［13］。非磷酸化的Bad可與Bcl-2結(jié)合形成異源二聚體，拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，而PIM1磷酸化Bad后使其失活，導(dǎo)致細(xì)胞生存與凋亡的平衡被打破，因此促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生存［15-17］。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果PIM1與患者的負(fù)性預(yù)后相關(guān)可能與PIM1磷酸化相應(yīng)的促凋亡蛋白，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡低下有關(guān)。

總之，在DLBCL患者中，PIM1高表達(dá)與化療反應(yīng)性低和總生存短相關(guān)。但我們的實(shí)驗(yàn)樣本量較小，因此要經(jīng)過(guò)大樣本和不同人群的研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)我們的發(fā)現(xiàn)，PIM1才有可能成為DLBCL的預(yù)后標(biāo)志。

另外，PIM1具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的特性和在腫瘤的形成中具有多樣的生物學(xué)作用，使得PIM1可以成為一種治療的靶點(diǎn)［18］。

致謝 衷心感謝上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第六人民醫(yī)院病理科張惠箴主任及病理科其他老師和南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科老師為我們實(shí)驗(yàn)提供的幫助。

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