干擾素誘導蛋白16在結直腸癌中的表達及其與K-ras基因突變的相關性研究

鄒云蓮 唐慧 撒亞蓮 楊慧 王林坪 郭強 嚴新民

云南省第一人民醫(yī)院，昆明醫(yī)學院附屬昆華醫(yī)院，云南 昆明 650032

干擾素誘導蛋白16(interferon induced 16，IFI16)屬于干擾素誘導的人HIN 200家族成員。它是一種核蛋白，包含多個調節(jié)區(qū)，如DNA結合區(qū)、轉錄區(qū)和DAPIN/PAAD區(qū)(domain in apoptosis and interferon response/pyrin AIM ASC and death domain-like)。IFI16在造血細胞、成纖維細胞和上皮細胞核中均有不同程度的表達，在體內作為一種轉錄調節(jié)子參與細胞周期、分化調節(jié)以及炎癥反應。最近的研究資料顯示，IFI16表達減弱或消失與前列腺癌及乳腺癌的發(fā)生密切相關［1-2］。本實驗室曾利用基因微陣列技術(microarray)初步分析了結直腸腺癌組織中相對于結直腸腺瘤與正常腸黏膜之異?；罨幕?，其中表達倍數差異最高的基因之一為IFI16［3］。為驗證芯片結果，本研究采用免疫組化SP法檢測結直腸腺瘤組織中IFI16的異常表達狀況，并探討其與結直腸癌發(fā)生的早期基因事件——K-ras基因突變間的相關性。

1 資料和方法

1.1 材料

收集云南省第一人民醫(yī)院病理科2008—2009年門診及手術獲得的結直腸癌石蠟標本61例，其中男性27例，女性34例，平均年齡62.2歲；結直腸腺瘤石蠟組織標本28例，其中男性13例，女性15例，平均年齡60.5歲；健康人群結直腸黏膜為本院消化科門診內鏡室顯微結腸鏡嵌取經石蠟包埋組織，并經病理證實為正常組織，共18例，其中男性8例，女性10例，平均年齡55.4歲。所有病例在采集標本時均未接受放化學治療，健康對照及病例均知情并同意提供組織標本，最后經病理檢查證實。

IFI16單克隆抗體購自Abcam公司，即用型免疫組化超敏SP試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新公司。K-ras基因引物參照文獻［4］由上海生物工程有限公司合成。擴增所需的Taq酶及dNTP購自大連寶生物公司，MvaI內切酶購自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 石蠟組織標本免疫組化及結果判定 石蠟切片經常規(guī)二甲苯脫蠟，95%、80%、75%及50%梯度酒精水化后，經pH=6.0的檸檬酸鹽緩沖溶液微波修復15 min，取出自然冷卻。采用SP染色法，一抗工作濃度為1∶50，實驗步驟按照試劑盒說明書進行。以PBS代替一抗做陰性對照。經顯色劑顯色后，光鏡下觀察染色結果，胞核著色為陽性，評分由2位病理醫(yī)師獨立打分，評分標準由染色強度和染色細胞百分比綜合評定。首先按陽性細胞所占百分比評分：陰性為0分，陽性細胞數≤10%為1分，>10%～50%為2分，>50%～75%為3分，＞75%為4分；再按染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；最后按兩者乘積分數分為4個等級，“-”：0～2分，“+”：3～4分，“++”：6～8分，“+++”：9～12分。我們將分數≥3定為陽性，＜3為陰性。

1.2.2 PCR及電泳 采用常規(guī)二甲苯脫蠟提取石蠟包埋組織DNA，梯度酒精并水化，應用PCR-RFLP法檢測K-ras基因12密碼子突變。實驗方法參照文獻［4］進行。產物經連續(xù)2次PCR擴增后，經MvaI酶切37 ℃消化過夜，4%瓊脂糖凝膠電泳判定結果。野生型由于保留酶切位點，PCR產物切割為106 bp電泳條帶；而突變型標本由于密碼子的變異導致酶切位點的消失，PCR產物不能切割，獲得的電泳條帶為135 bp。隨機抽取K-ras突變型和野生型標本各5例進行測序，測序結果與酶切結果比對，以評判實驗結果的可靠性。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件，比較IFI16在不同組間陽性率的表達，不同結直腸病理類型與各臨床、病理因素的相關性分析采用χ2檢驗或精確概率檢驗，相關性檢驗采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 IFI16在結直腸正常組織、腺瘤及腺癌中的表達情況

檢測組織標本共計107例，其中腸腺癌標本61例(IFI16陽性標本30例，陽性率為49.2%)，腺瘤標本28例(IFI16陽性標本共7例，陽性率為25%)；健康人群結直腸黏膜標本18例(全為陰性表達，圖1)。腺癌與腺瘤之間，腺瘤與正常結直腸黏膜組織中IFI16表達差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=4.056，P=0.044；χ2=5.308，P=0.021)。IFI16的表達隨著結直腸腺瘤癌變這一病理進程逐步升高。IFI16表達與患者病理組織分級(χ2=0.181，P=0.674)、Duke’s分期(χ2=2.083，P=0.149)、年齡(χ2=0.049，P=0.712)和性別(χ2=1.032，P=0.310)無相關性。

2.2 K-ras基因第12密碼子變異分析

本研究共提取了54例石蠟包埋組織的DNA，有擴增結果的47例。標本經AvaI切割，47例檢測標本中野生型29例(占61.7%)，突變型18例(占38.3%)。為評判酶切結果的可靠性，隨機抽取10例進行基因測序，10例標本測序結果與酶切結果完全吻合(圖2、3)。K-ras基因的變異與患者的性別(χ2=0.154，P=0.697)，年齡(χ2=0.692，P=0.813)，Duke’s分期(χ2=0.068，P=0.685)，病理組織分級(χ2=0.071，P=0.636)差異均無統(tǒng)計意義。

2.3 結直腸癌組織中IFI16表達與K-ras基因突變之間的相關性

在47例擴增陽性的標本中，29例K-ras野生型標本中有16例IFI16陽性表達(占55.2%)；突變型標本18例中有8例IFI16陽性表達(占44.4%)，K-ras基因變異與IFI16表達差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.178，P=0.278＞0.05)。值得關注的是，在18例突變型患者中，有13例結直腸腺癌組織細胞質中檢測到IFI16陽性表達(圖1D)，而在29例K-ras野生型患者中，僅4例有IFI16的胞質異位表達，K-ras基因變異與IFI16異位表達差異有統(tǒng)計學意義(χ2=18.939，P=0.000，表1)。經Pearson等級相關分析，兩者之間呈顯著相關性(r=0.635)。IFI16異位與病理組織分級(χ2=1.423，P=0.233)及Duke’s分期(χ2=1.466，P=0.224)差異均無統(tǒng)計學意義。

3 討 論

IFI16屬干擾素誘導的人蛋白家族HIN200成員之一。其結構具有該家族共有的結構基序，如N端的DAPIN/PAAD區(qū)、DNA結合區(qū)、核定位區(qū)及C端200氨基酸重復區(qū)域，它能介導蛋白與蛋白及蛋白與DNA之間的相互作用。IFI16首先在造血干細胞中被發(fā)現(xiàn)，后來被發(fā)現(xiàn)在淋巴細胞、二倍體成纖維細胞、血管內皮細胞及上皮細胞胞核中均有不同程度的表達，其生理功能主要在胞核中進行。在快速增殖的人皮膚鱗狀上皮基底層中IFI16高表達，表明其在組織的正常分化與增殖中具有重要的生理功能［5］。

表1 IFI16表達及IFI16定位與K-ras基因相關性分析Tab.1 Expression rate of IFI16 in adenocinoma cells and the correlation of the IFI16 location and K-ras gene statusn(%)

目前愈來愈多的證據表明，IFI16作為腫瘤抑制因子，與多種蛋白或基因如pRb、p53及BRCA1相互作用，參與細胞增殖、凋亡和分化的調控，而蛋白的表達或消失與腫瘤的發(fā)生密切相關［6-8］，因此恢復該基因的表達能促進腫瘤細胞的凋亡，抑制新生血管生成，并通過釋放趨化因子招募循環(huán)中的巨噬細胞起到抗腫瘤活性的作用［1-2，9］。然而，IFI16對腫瘤的抑制作用并不是絕對的。Yu等［10］發(fā)現(xiàn)在肝癌發(fā)病機制中，IFI16可能作為癌基因的下游靶基因參與了肝癌的發(fā)病過程，它通過降低P21waf1/ciP1來促進細胞周期進展，為誘導細胞增殖所必須。在睪丸精原細胞原位癌中IFI16的表達均較正常睪丸顯著升高［11］。IFI16表達水平的升高促進B細胞惡性腫瘤的形成和發(fā)展［12］，缺失了Rb蛋白結合基序的干擾素誘導鼠蛋白p204顯示出癌基因的行為特征［13］。IFI16在機體中可能作為一把雙刃劍扮演不同角色，即IFI16的持續(xù)表達導致細胞生長抑制，而在合適環(huán)境可改變自身，或與不同的結合子結合來激活細胞，使其免于凋亡而獲得重生。

結直腸癌近年在中國呈快速上升的趨勢，目前普遍認為結直腸腺瘤是腺癌的癌前病變。我們應用基因微陣列技術篩查發(fā)生、發(fā)展過程中的早期基因事件，結果發(fā)現(xiàn)IFI16在腺瘤向腺癌轉化過程中mRNA顯著增加［3］。這提示IFI16可能作為促進因子參與腺瘤向腺癌的轉化。本研究我們應用免疫組化技術對正常結直腸黏膜組織、腺瘤和腺癌組織進行了IFI16表達分析，結果表明，正常結直腸黏膜組織向結直腸腺瘤最后發(fā)展為腺癌過程中IFI16表達逐步增加，IFI16表達率為49.2%，腺瘤蛋白表達率為25%，正常為0%，三者兩兩相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這從蛋白水平上進一步證實，結直腸腺瘤向腺癌轉化過程中，IFI16作為促進因子而非腫瘤抑制因子參與結直腸癌的發(fā)生。IFI16的抑癌或促癌作用確實存在著顯著差異，而這種差異是由于其本身的基因結構發(fā)生了改變，還是與不同結合子或基因結合所導致尚需大量的后續(xù)研究加以解釋和驗證。

我們在結直腸腺癌組織中除觀察到典型的胞核表達外，還發(fā)現(xiàn)胞質中有IFI16表達。2004年，Nobuko等［1］首先在乳腺癌組織中觀察到IFI16的胞質異位。Ding等［14］在探討p204蛋白(該蛋白與IFI16同一家族，但在鼠體內表達)與K-ras基因關系時提出p204蛋白作為K-ras蛋白激活的負性反饋抑制子參與機體的生理調控。K-ras基因突變與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。在結直腸癌發(fā)展進程中IFI16是否與K-ras基因存在同樣的反饋抑制機制？因此，本研究對收集的病例進行了K-ras基因突變研究，并探討其與IFI16表達的相關性。在有擴增結果的47例標本中，K-ras基因突變率為38.3%，該結果與國內報道的基本一致［15］。IFI16在K-ras野生型較突變型組織中表達有所下調，但差異無統(tǒng)計學意義。而IFI16胞核至胞質的異位表達與K-ras基因變異差異有統(tǒng)計學意義，兩者顯著相關。這在一定程度上提示IFI16的胞質異位與結直腸癌的發(fā)生密切相關，突變的K-ras基因通過募集IFI16胞核轉移至胞質并與之結合，調控K-ras基因活性及下游信號傳遞。但由于本研究的樣本數量有限，且對K-ras基因突變僅限于12密碼子，尚需加大樣本數量及對K-ras基因多個位點研究以完善研究結果。

總之，本研究應用免疫組化方法對組織中IFI16檢測的結果，進一步證實了我們之前利用基因微陣列技術所得的結果。變異的K-ras基因通過募集IFI16胞核至胞質的異位表達，并與之相互作用，在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

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