NGX6和CyclinD1蛋白在食管鱗癌組織中的表達及意義

王國磊 蔣慶峰 張瑞祥 申思寧 李印

河南省腫瘤醫(yī)院胸外科，鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008

腫瘤分子生物學研究表明，幾乎所有的癌基因、抑癌基因通過直接或者間接的作用最終都會導致細胞周期的異常，使腫瘤細胞呈失控性生長。鼻咽癌相關基因6(nasopharyngeal carcinoma-associated gene 6，NGX6)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤抑癌基因［1］，能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，而轉染NGX6基因的HNE1細胞能夠延長裸鼠的成瘤時間。NGX6基因在結直腸癌、胃癌組織和體外培養(yǎng)的鼻咽癌細胞等惡性腫瘤中表達下調，并與腫瘤的增殖和轉移密切相關［2-3］。細胞周期素D1(CyclinD1)是細胞周期的正調節(jié)因子，CyclinD1蛋白過表達可以加速細胞G1期向S期轉化，促使細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中過表達，并且過表達患者的生存率明顯低于低表達者，提示其可作為判斷腫瘤預后的重要指標［4-5］。本研究檢測食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織和正常食管黏膜組織中NGX6和CyclinD1蛋白的表達，以探討NGX6和CyclinD1蛋白異常表達與食管鱗癌發(fā)生的關系及其臨床意義，并分析兩種蛋白表達的相關性。

1 資料和方法

1.1 研究對象

60例組織標本系河南省腫瘤醫(yī)院2006年8月—2009年3月食管癌新鮮手術切除標本，病理證實均為鱗癌，并取相應的癌旁不典型增生標本30例及正常食管黏膜標本20例。癌旁不典型增生組織取自距癌組織邊緣3 cm以內的組織，正常組織取自手術殘端，距癌組織3 cm以上。其中男性33例，女性27例，年齡40～78歲，平均(60.6±16.3)歲，術前均未行放療及化療。食管癌組織學分級：高中分化35例，低分化25例。按UICC(1997)TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期28例。浸潤深度：淺肌層16例，深肌層20例及外膜組24例。有淋巴結轉移26例，無淋巴結轉移34例。

1.2 試劑

兔抗人NGX6多克隆抗體購于武漢博士德生物工程公司；即用型兔抗人CyclinD1單克隆抗體、SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉有限公司。

1.3 研究方法

實驗方法參照免疫組化SP試劑盒說明書進行操作，用已知的陽性對照片作為陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定

以腫瘤細胞或者正常細胞的細胞質和細胞膜內出現(xiàn)棕黃色顆粒為NGX6陽性細胞；以腫瘤細胞胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒為CyclinD1陽性細胞。在顯微鏡400倍視野下隨機選取5個有代表性的不同區(qū)域，每個視野的得分由陽性細胞的比例和顯色強度兩方面決定。陽性細胞比例為盲觀測計數(shù)200個腫瘤細胞中陽性染色細胞的比例。記分標準：<5%記分為0，5%～25%記分為1，26%～50%記分為2，51%～75%記分為3，>75%記分為4。著色強度：不著色記分為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3,然后根據(jù)兩者乘積的積分進行統(tǒng)計學處理。依據(jù)評分判斷染色結果：評分0～1為(-)，2～4為(+)，5～7為(++)，≥8為(+++)［6］。

1.5 隨訪

60例食管癌患者中47例有1年以上的隨訪資料，失訪13例；隨訪3年以上38例，存活12例，因腫瘤復發(fā)、廣泛轉移死亡26例。分別取癌組織、癌旁不典型增生組織及正常組織固定于4%的多聚甲醛中，然后石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，陽性率之間的比較采用χ2檢驗，兩變量之間的關系分析采用Spearman等級相關分析表示，檢驗標準以α=0.05為顯著性檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織和正常食管黏膜組織中NGX6和CyclinD1蛋白表達

所有標本均成功進行了兩種蛋白的檢測，統(tǒng)計學處理顯示，食管鱗癌組織中NGX6蛋白陽性表達率明顯低于正常食管黏膜組織(P<0.05)；食管鱗癌組織中CyclinD1蛋白陽性表達率明顯高于癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織(P<0.05，表1)。如圖1所示，食管組織中NGX6和CyclinD1 陽性表達。

表1 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織中NGX6和CyclinD1蛋白表達Tab.1 The expression of NGX6 and CyclinD1 in esophageal squamous cell carcinoma tissues, paracancerous tissues and normal esophageal epithelial tissues(n)

2.2 NGX6和CyclinD1蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系

NGX6和CyclinD1蛋白表達分別與食管鱗癌臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移有關(P均<0.05)；而與患者性別、年齡及病理分級無關(P>0.05；表2、3)。

2.3 NGX6和CyclinD1蛋白在食管鱗癌中表達的關系

NGX6和CyclinD1蛋白在食管鱗癌組織中的表達呈明顯的負相關 (P<0.05，表4)。

表2 NGX6蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系Tab.2 The relationship between NGX6 expression and the clinicopathological features of esophageal squamous cell c arcinoma(n)

表3 CyclinD1蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系Tab. 3 Correlations of CyclinD1 expression to clinicopathologic features of esophageal squamous cell carcinoma(n)

表4 NGX6蛋白與CyclinD1蛋白在食管鱗癌中表達的關系Tab.4 The relationship between the expression of NGX6 and CyclinD 1 in the esophageal squamous cell carcinoma tissues(n)

3 討 論

NGX6是新近克隆的候選抑癌基因，位于染色體9p21-22，而該區(qū)域的等位基因雜合性缺失現(xiàn)象是多種腫瘤的共同事件［7-8］。NGX6基因由10個外顯子組成，cDNA全長2 134 bp，編碼一種含有338個氨基酸的跨膜蛋白質［9］。通過對轉染NGX6的人結腸癌細胞HT-29的生物學性狀的研究，Wang等［10］發(fā)現(xiàn)NGX6高表達能延緩HT-29細胞周期由G0/G1期至S期的進程，并能抑制裸鼠成瘤。有研究表明，NGX6基因在人結腸癌組織中表達下調，且伴有在轉移的結腸癌組織中表達下調率明顯高于無轉移的結腸癌組織的現(xiàn)象，提示NGX6通過低表達或者表達缺失參與結腸癌的增殖和轉移過程［11］。本實驗結果顯示，NGX6在由正常食管黏膜組織、癌旁不典型增生組織到食管鱗癌組織的演變過程中，其蛋白陽性表達率依次降低，三者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示NGX6蛋白的低表達及表達缺失可能成為食管鱗癌發(fā)生的早期標志，對于食管鱗癌的早期診斷有一定的臨床意義。進一步研究顯示，NGX6蛋白表達與食管鱗癌臨床分期、腫瘤浸潤、轉移有關，而與患者性別、年齡及病理分級無關。提示NGX6失活可能參與了食管鱗癌的局部浸潤和遠處轉移的過程。

CyclinD1是細胞周期素家族中最重要的成員，定位于人染色體11q13，由5個外顯子組成，編碼295個氨基酸組成的蛋白質，是細胞周期的正性調控因子。CyclinD1高表達可激活CDK4，使抑癌基因表達產物Rb蛋白失去對細胞周期的制動功能，促使細胞由G1期向S期演進。CyclinD1在正常組織中表達很少或者不表達，而在肝癌、肺癌、前列腺癌及乳腺癌等多種腫瘤中存在過表達，并成為評估腫瘤進展及預后的重要指標之一［12］。本實驗結果與上述研究結果一致。食管鱗癌組織中CyclinD1蛋白陽性表達率高于癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織，差異有統(tǒng)計學意義；進一步研究顯示，CyclinD1表達與食管癌臨床分期和腫瘤轉移有關。這可能由于CyclinD1蛋白過表達使正常食管黏膜細胞周期異常，從而導致正常細胞的惡性轉化及食管鱗癌的浸潤轉移。另外，本研究還觀察了NGX6和CyclinD1蛋白在食管鱗癌組織中表達的相關性，發(fā)現(xiàn)NGX6和CyclinD1蛋白的陽性表達呈顯著負相關。表明兩者可能在食管鱗癌的發(fā)生和浸潤轉移過程中起著一定程度的協(xié)同作用。研究證實，NGX6可下調結腸癌細胞HT-29中JNK/SAPK通路中的重要激活蛋白MADD(MAP-kinase activating death domain)表達的3倍以上，并可降低EGFR和CyclinD1的表達，抑制結腸癌細胞周期由G0/G1到S期的轉化［13］。由此我們推測NGX6表達缺失可能增強CyclinD1信號傳導通路的活性，使細胞周期發(fā)生改變，正常細胞的生長失控、異常增殖，最終導致腫瘤的發(fā)生。兩者聯(lián)合檢測對于闡明食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展機制以及腫瘤的早期診斷和預后評估具有重要的臨床意義。

［1］ Li J, Tan C, Li GY, et al.Search for differentially expressed proteins involved in the treatment of human nasopharyngeal carcinoma cells with NGX6 using two dimensional electrophoresis and mass spectrometry［J］.Prog Biochem Biophys, 2001, 28(4): 573-578.

［2］ Ma J, Li J, Li GY, et al.Profiling genes differentially expressed in NGX6 overexpressed nasopharyngeal carcinoma cells by cDNA array［J］.J Cancer Res Clin Oncol, 2002, 128(12):683-690.

［3］ Zhang XM, Wang XY, Sheng SR, et al.Expressed of tumor related genes NGX6, NAG-7, BRD7 in gastric and colorectal cancer［J］.World J Gastroenterol, 2003, 9(8): 1729-1733.

［4］ Ikehara M, Oshita F, Ito H, et al.Expression of CyclinD1 but not of CyclinE is an indicator of poor prognosis in small adenocarcinoma of the lung［J］.Oncol Rep, 2003, 10(1):137-139.

［5］ Umekita Y, Ohi Y, Sagara Y, et al.Overexpression of cyclinD1 predicts for poor prognosis in estrogen receptor negative breast cancer patients［J］.Int J Cancer, 2002, 98(3): 415-418.

［6］ 許良中, 楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準［J］.中國癌癥雜志, 1996, 6(4): 229-231.

［7］ Tadokoro H, Shigihara T, Ikeda T, et al.Two distinct pathways of p16 gene inactivation in gallbladder cancer［J］.World J Gastroenterol, 2007, 13(47): 6396-6403.

［8］ Ma J, Zhou J, Fan S, et al.Role of a novel EGF-like domaincontaining gene NGX6 in cell adhesion modulation in nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Carcinogenesis, 2005,26(2): 281-291.

［9］ Guo Q, Wu M, Lian P, et al.Synergistic effect of indomethacin and NGX6 on proliferation and invasion by human colorectal cancer cells through modulation of the Wnt/beta-catenin signaling pathway［J］.Mol Cell Biochem, 2009, 330(1-2):71-81.

［10］ Wang XY, Sheng SR, Liu HY, et al.Effects of tumor suppressor gene NGX6 on growth of human colon cancer cell line HT-29［J］.World Chin J Digest, 2004, 12(3): 574-579.

［11］ Zhang XM, Sheng SR, Wang XY, et al.Expression of tumor related gene NGX6 in gastric cancer and colorectal cancer［J］.World Chin J Digest, 2002, 10(8): 873-876.

［12］ Mukhopadhyay A, Banerjee S, Stafford LJ, et al.Curcumininduced suppression of cell proliferation correlates with down-regulation of cyclinD1 expression and CDK4-mediated retinoblastoma protein phosphorylation［J］.Oncogene,2002, 21(5 7): 8852-8861.

［13］ Wang XY, Sheng SR, Liu F, et al.Effects of NGX6 gene on cell cycle in colon cancer cell line HT-29［J］.Prog Biochem Biophys, 2006, 33(1): 1-6.