應(yīng)用MALDI-TOFMS技術(shù)建立賁門癌血清蛋白指紋圖譜診斷模型

孟君 劉麗華 單保恩 艾軍 張超 張璁 韓麗娜

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北省腫瘤研究所，河北 石家莊 050011

賁門癌是常見的消化道惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1-3］。賁門癌顯著的流行病學(xué)特征是與食管癌高發(fā)區(qū)地域性分布的一致性［4-5］，河南、河北、山西交界的太行山一帶的農(nóng)村是世界上食管癌和賁門癌發(fā)病率和病死率最高的地區(qū)［6-7］。賁門癌具有分期晚、轉(zhuǎn)移早、分化程度低等特點(diǎn)，內(nèi)鏡和上消化道造影是主要診斷方法，但痛苦大、費(fèi)用高、患者依從性差。因此，尋找有效的腫瘤標(biāo)志物用于賁門癌高危人群的“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”，對(duì)于提高患者的生存率，延長(zhǎng)生存時(shí)間具有重要意義。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的迅速發(fā)展推進(jìn)了腫瘤標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的進(jìn)程。在過去10年中，基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)已經(jīng)成為腫瘤學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)組學(xué)工具［8-9］。這項(xiàng)技術(shù)的高通量、微上樣量、適合大樣本檢測(cè)等特點(diǎn)使其成為發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證血液等體液中腫瘤標(biāo)志物的新技術(shù)平臺(tái)。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)賁門癌患者及健康對(duì)照組血清進(jìn)行檢測(cè)，建立賁門癌血清蛋白診斷模型，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2009年3月—2010年5月就診于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科的賁門癌患者血清標(biāo)本共63例(賁門癌組)，其中男性56例、女性7例，年齡41～78歲，平均(63.8±8.4)歲，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為賁門腺癌，均未接受治療。健康對(duì)照組血清54例，來自于健康體檢者，其中男性43例、女性11例，年齡52～77歲，平均(65.4±6.5)歲。兩組間年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對(duì)象都簽署知情同意書，并報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批審?fù)狻？崭範(fàn)顟B(tài)下采集靜脈血，分離血清標(biāo)本，嚴(yán)格按照ClinProt標(biāo)準(zhǔn)化方案處理，4 ℃靜置1 h后以2 000 r/min(r=0.1 m)離心5 min，取血清再次以10 000 r/min(r=0.06 m)離心10 min，分裝后-80 ℃保存。保證實(shí)驗(yàn)標(biāo)本僅凍融1次，減少小分子蛋白或多肽的損失。

1.2 主要儀器和試劑

乙腈(CHCA)、Clinprot弱陽離子螯合磁珠(MB-WCX)試劑盒、多肽及蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自德國(guó)Bruker Daltionics公司，三氟乙酸購自美國(guó)Alfa Aesar公司。其他試劑均購自美國(guó)Sigma公司。AtuoflexⅢ型質(zhì)譜儀為德國(guó)Bruker Daltonics公司產(chǎn)品。

1.3 血清蛋白制備

血清標(biāo)本冰浴解凍，4 ℃、10 000 r/min(r=0.06 m)離心10 min。取5 μL樣品加入已裝好10 μL結(jié)合緩沖液(binding solution，BS)和10 μL WCX磁珠懸濁液的樣品管中，充分混勻后置于磁珠分離器上靜置5 min；小心吸去懸浮液體，加入磁珠清洗液(washing solution，WS)，在磁珠分離器前后兩孔間反復(fù)移動(dòng)樣品管10次，重復(fù)清洗3次；以5 μL磁珠洗脫緩沖液(elution solution，ES)洗脫磁珠結(jié)合的蛋白，置于新樣品管中，加入5 μL穩(wěn)定緩沖液(stable solution，SS)吸打混勻后即可用于后續(xù)質(zhì)譜分析。

將1 μL制備好的蛋白樣本隨即點(diǎn)樣于384普通靶(Bruker Daltonics公司)上后，每個(gè)樣品點(diǎn)加1 μL基質(zhì)(3 mg/mL CHCA，50%ACN，2%TFA)，進(jìn)行MALDI-TOF MS 分析。采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量校正。以標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行質(zhì)量控制，每7個(gè)樣本與1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血清匹配，并同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置及數(shù)據(jù)采集

MALDI-TOF質(zhì)譜儀(Autoflex Ⅲ型)數(shù)據(jù)采集方法應(yīng)用ClinProt線性陽離子模式，參數(shù)設(shè)置如下：第一離子源20.0 kV；第二離子源18.4 kV；以25 Hz氮激光照射激發(fā)電離。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)化后的數(shù)據(jù)收集相對(duì)分子質(zhì)量范圍為(1～15)×103。每例制備好的血清標(biāo)本在靶上重復(fù)4個(gè)點(diǎn)，同一靶點(diǎn)的不同結(jié)晶點(diǎn)進(jìn)行多點(diǎn)采集，每個(gè)點(diǎn)采集200 shots，選10個(gè)不同位置累計(jì)2 000 shots。為了增加檢測(cè)敏感性，我們先以38%的激光強(qiáng)度轟擊，之后換用24%的激光強(qiáng)度采集圖譜。

1.5 生物信息學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)采用浙江大學(xué)腫瘤研究所設(shè)計(jì)的ZUCI-蛋白芯片數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(ZUCI-Protein Chip Data Analyze System，ZUCI-PCDAS)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)采集圖譜進(jìn)行均一化處理，去噪平滑，過濾信噪比<2的蛋白峰，對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)荷比峰做Wilconxon 秩和檢驗(yàn)，篩選出有差異的質(zhì)荷比峰。通過遺傳算法結(jié)合支持向量機(jī)運(yùn)算建立賁門癌血清蛋白指紋圖譜模型，以留一法進(jìn)行交叉驗(yàn)證。所有樣本隨機(jī)劃分，2/3樣本作為訓(xùn)練組，1/3樣本作為盲法測(cè)試組，并將訓(xùn)練組樣本再隨機(jī)劃分出1/3進(jìn)行交叉驗(yàn)證，經(jīng)軟件包運(yùn)算后計(jì)算每個(gè)樣本的平均預(yù)測(cè)值，并計(jì)算靈敏度和特異度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)初步篩選出的蛋白質(zhì)荷比峰進(jìn)行t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)用Mann-Whitney檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s )表示，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MALDI-TOF質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)采集的重復(fù)性分析

在MALDI-TOF質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)采集中，實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)品校正平均相對(duì)分子質(zhì)量偏差<0.01%。作為實(shí)驗(yàn)流程質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)譜圖采集后，與數(shù)據(jù)庫中已有的對(duì)應(yīng)WCX磁珠相同采集方法的標(biāo)準(zhǔn)血清數(shù)據(jù)比較，變異系數(shù)(CV)<30%。

2.2 賁門癌組和健康對(duì)照組血清差異蛋白質(zhì)荷比峰的篩選

賁門癌患者和健康對(duì)照組的血清樣本分別經(jīng)WCX磁珠處理后，用Autoflex Ⅲ型質(zhì)譜儀檢測(cè)，在相對(duì)分子質(zhì)量(1～15)×103范圍內(nèi)，共檢測(cè)到149個(gè)蛋白質(zhì)荷比峰，其中69個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。P值越小，說明在兩組中差異越顯著，單個(gè)質(zhì)荷比峰的分組能力越強(qiáng)。

2.3 賁門癌蛋白指紋圖譜診斷模型的建立及驗(yàn)證

利用ZUCI-PCDAS蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)分析軟件包，通過GA結(jié)合SVM運(yùn)算，最終篩選出10個(gè)差異最顯著的蛋白質(zhì)荷比峰建立診斷模型(表1)。與正常對(duì)照組比較，其中m/z為2 863、3 241、2 295和2 671 的4個(gè)蛋白峰在賁門癌組中高表達(dá)；而m/z為4 655、3 883、3 952、2 741、1 546和4 054的6個(gè)蛋白峰在賁門癌組中低表達(dá)。圖1、2顯示的是m/z為2 836和3 952的2個(gè)蛋白峰在兩組中的表達(dá)情況。該模型能夠很好的區(qū)分賁門癌組和健康對(duì)照組(圖3)。

以留一法進(jìn)行交叉驗(yàn)證評(píng)估診斷模型的判別效果。將所有血清樣本隨機(jī)分為訓(xùn)練組和盲法測(cè)試組，表2顯示的是兩組的樣本分布情況。經(jīng)盲法交叉測(cè)試，21例賁門癌患者中有20例被準(zhǔn)確檢出為賁門癌，18例健康志愿者中有16例被確定為健康者。結(jié)果表明，該診斷模型的靈敏度為96.83%，特異度為90.74%，陽性預(yù)測(cè)值為92.42%。

表1 賁門癌患者與健康對(duì)照組中10個(gè)差異蛋白質(zhì)荷比峰的比較Tab.1 Comparison of 10 differential protein m/z peaks between GCA patients and healthy controls

表2 訓(xùn)練組和盲法測(cè)試組樣本分布情況Tab.2 Study population used in training set and validation set

3 討 論

賁門癌與食管癌高發(fā)區(qū)地域性分布一致是顯著的流行病學(xué)特征［4-5］。然而近年來對(duì)高發(fā)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行篩查發(fā)現(xiàn)，內(nèi)鏡下碘染色指導(dǎo)活檢技術(shù)對(duì)食管鱗狀上皮早期癌及癌前病變具有良好的檢出能力，但對(duì)賁門癌及癌前病變的檢出尚不理想，限制了高發(fā)區(qū)早診斷早治療的整體效果。賁門癌的另一顯著流行病學(xué)特征是與胃遠(yuǎn)側(cè)部位腫瘤的不一致性［10］。在過去的幾十年里，世界上很多國(guó)家和地區(qū)的胃癌發(fā)生率明顯下降［11-12］，而賁門癌的發(fā)生率卻呈上升趨勢(shì)［13-14］。在中國(guó)北方地區(qū)，90%的城市居民及95%的農(nóng)村居民賁門癌首次被確診時(shí)已屬于中、晚期［15］。賁門癌預(yù)后差，5年生存率僅為28.5%［16］。對(duì)高危人群進(jìn)行定期檢查，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，可以提高患者的生存率、延長(zhǎng)生存時(shí)間。因此，尋找敏感、特異的腫瘤標(biāo)志物，是提高賁門癌早期診斷率和降低死亡率的重要手段，對(duì)于賁門癌的基礎(chǔ)和臨床研究也具有非常重要的意義。

近年來，蛋白組學(xué)研究發(fā)展迅速，尤其在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方面顯示出特有的高靈敏度、高特異度等優(yōu)點(diǎn)。這一領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)可以對(duì)多種臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，包括血液、腦脊液、唾液和尿液等。血液中含有正常和癌組織釋放的蛋白和肽段［17］，標(biāo)本獲取簡(jiǎn)便，對(duì)人體損傷小且適合長(zhǎng)期的檢測(cè)觀察，因而得到廣泛的應(yīng)用。血液標(biāo)本收集和處理的標(biāo)準(zhǔn)化問題也是應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Timms等［18］研究了收集血液的容器、凝血時(shí)間、運(yùn)送時(shí)間、溫度和儲(chǔ)存方法的不同對(duì)血液中蛋白及多肽的影響，并建立了用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)化樣本處理流程。他們指出：嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化流程進(jìn)行血液樣本的收集處理，對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)研究至關(guān)重要。凍融次數(shù)是否對(duì)血液標(biāo)本有影響存在一些爭(zhēng)議，一部分學(xué)者認(rèn)為，凍融數(shù)次對(duì)于血液蛋白指紋圖譜的影響是微乎其微的［19］；而大多數(shù)的學(xué)者認(rèn)為，血液反復(fù)凍融后成分會(huì)發(fā)生變化，其原因可能與肽的聚合、沉淀、表面吸附等一系列變化有關(guān)，因此要盡量避免血液標(biāo)本的反復(fù)凍融［20］。

本實(shí)驗(yàn)在血液標(biāo)本的收集和處理過程中，嚴(yán)格按照ClinProt標(biāo)準(zhǔn)化流程，規(guī)范從臨床采集、運(yùn)送、處理以及存儲(chǔ)各個(gè)環(huán)節(jié)，最大程度上避免人為因素對(duì)標(biāo)本中蛋白含量的影響；同時(shí)我們采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量校正，以標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行質(zhì)量控制；在數(shù)據(jù)采集方面，每例制備好的血清標(biāo)本在靶上重復(fù)4個(gè)點(diǎn)，對(duì)同一靶點(diǎn)的不同結(jié)晶點(diǎn)進(jìn)行多點(diǎn)采集。以上的分析前處理保證了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，測(cè)得實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)品校正平均相對(duì)分子質(zhì)量偏差<0.01%。作為實(shí)驗(yàn)流程質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)譜圖采集后，與數(shù)據(jù)庫中已有的對(duì)應(yīng)WCX磁珠相同采集方法的標(biāo)準(zhǔn)血清數(shù)據(jù)比較，CV<30%。說明嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化作業(yè)流程得到的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。

MALDI-TOF MS技術(shù)是廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)之一，且在血液腫瘤標(biāo)志物研究領(lǐng)域具有更大的優(yōu)勢(shì)［21］?，F(xiàn)在的研究致力于發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的一組蛋白或肽段并構(gòu)建基于多種特征的診斷模型［22］，從而避免用單一腫瘤標(biāo)志物或數(shù)個(gè)腫瘤標(biāo)志物的簡(jiǎn)單疊加檢測(cè)而產(chǎn)生的靈敏度和特異度的矛盾。MALDI-TOF MS方法能夠識(shí)別鑒定細(xì)胞、組織或機(jī)體的全部蛋白質(zhì)，提供一組蛋白質(zhì)的功能及其模式的信息，為較整體的檢測(cè)提供了可能。Schwamborn等［23］以磁珠處理105例膀胱癌患者、98例健康人群及45例前列腺癌患者血清標(biāo)本后，用MALDI-TOF MS的方法檢測(cè)其蛋白指紋圖譜并建立膀胱癌診斷模型，該模型靈敏度和特異度分別為94.1%、86.5%；其中早期賁門癌的檢出率達(dá)到96%。Liu等［25］應(yīng)用MALDI的ClinProt方法和磁珠分選技術(shù)檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌患者及健康志愿者血清標(biāo)本，數(shù)據(jù)分析后選擇11個(gè)蛋白峰建立診斷模型，其中4個(gè)蛋白高表達(dá)于食管鱗癌組，7個(gè)蛋白呈低表達(dá)。聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果表明，其診斷靈敏度為90.0%，特異度為84.0%，陽性預(yù)測(cè)值為88.0%，陰性預(yù)測(cè)值為80.0%，為食管癌早期診斷提供了新的思路。

本研究利用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測(cè)賁門癌與健康對(duì)照組血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，ZUCIPCDAS軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用支持向量機(jī)方法建立判別模型，留一法交叉驗(yàn)證判定模型效果，經(jīng)過大量生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，最終篩選出正確診斷指數(shù)最高的10個(gè)蛋白質(zhì)荷比峰組合建立診斷模型，確保了診斷模型的準(zhǔn)確性與嚴(yán)謹(jǐn)性，優(yōu)于以往建模方案。本組賁門癌蛋白指紋圖診斷模型靈敏度96.83%，特異度90.74%，陽性預(yù)測(cè)值92.42%，能夠很好地將賁門癌患者和健康對(duì)照組進(jìn)行診斷區(qū)分，為賁門癌的診斷提供了新的思路和選擇。如果能夠繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，提高盲法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性與可靠性，并對(duì)診斷模型中的差異蛋白質(zhì)荷比峰進(jìn)行分離、純化鑒定，將會(huì)進(jìn)一步增加該模型臨床應(yīng)用的可行性，同時(shí)也為篩選賁門癌新的腫瘤標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。

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