SNAI1在85例結(jié)直腸癌患者組織中表達(dá)的研究

趙海燕 吳共發(fā) 王雅娟 韓慧霞

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 廣州 510515

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一 ，在美國(guó)已經(jīng)成為腫瘤死亡的首因；在上海也逐漸超過胃癌成為第二常見的惡性腫瘤［1］。以往研究發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）參與了惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移， SNAI1通過抑制E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)觸發(fā)EMT的發(fā)生，導(dǎo)致癌細(xì)胞喪失上皮特性，富于侵襲和轉(zhuǎn)移特性，是惡性腫瘤所必需的［2］。關(guān)于SNAI1的研究已經(jīng)多見報(bào)道，但是尚無采用配對(duì)方法比較結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中SNAI1表達(dá)的研究。在本研究中，我們通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)85例結(jié)直腸癌患者的癌旁正常黏膜組織、結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中SNAI1的表達(dá)情況，采取多種分組和多種統(tǒng)計(jì)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)分析比較，探討SNAI1在結(jié)直腸癌中的意義。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來源 收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院病理科2007年1月1日—2008年3月1日存檔的85例結(jié)直腸癌患者（高分化腺癌26例、中分化腺癌23例、低分化腺癌36例；Dukes A+B 45例，Dukes C+D 40例）的137個(gè)蠟塊，癌旁正常黏膜組織22例（距癌灶15 cm以上）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織30例均來自于85例結(jié)直腸癌患者?；颊吣挲g23～85歲（平均57.2歲），術(shù)前均未接受化療、放療。所有組織4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚切片，采用免疫組織化學(xué)二步法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 試劑 SP法檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉公司；SNAI1兔抗人多克隆抗體購自美國(guó)Bioworld公司。

1.3 SP法檢測(cè)SNAI1的表達(dá) 免疫組織化學(xué)方法按試劑盒說明書操作。SNAI1抗體的工作濃度為1∶200，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，SP法檢測(cè)試劑盒，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。PBS取代一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，⑴強(qiáng)度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。⑵隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)算100個(gè)腫瘤細(xì)胞，共計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率：1%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，50%～＜75%為3分，≥75%為4分。兩項(xiàng)得分相乘，4～7分為“+”，8～11分為“++”，滿12分為“+++”，“+～+++”為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多組比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，雙變量相關(guān)分析采用Spearman和Kendall’s tau-b檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SNAI1在正常結(jié)直腸組織、癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，SNAI1表達(dá)主要定位在細(xì)胞核內(nèi)（圖1）。多組比較顯示，SNAI1在正常結(jié)直腸黏膜組織、原發(fā)癌灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)明顯不同，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=50.496，P=0.000），以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)最強(qiáng)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，SNAI1在原發(fā)性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)（Z=-6.018，P=0.000）；低分化癌組織的表達(dá)顯著高于高中分化癌組織（Z=-2.467，P=0.014），SNAI1在Dukes A+B與Dukes C+D分期中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.975，P=0.330）。雙變量相關(guān)分析顯示組織類別（即正常結(jié)直腸黏膜組織、高分化癌組織、中分化癌組織、低分化癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織）與SNAI1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（Kendall’s tau-b相關(guān)系數(shù)r=0.532＞0.5，P=0.000；Spearman’s 相關(guān)系數(shù)r=0.595＞0.5，P=0.000，表1）。

2.2 SNAI1在高、中、低分化癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的對(duì)比表達(dá) 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織的表達(dá)顯著高于原發(fā)性結(jié)直腸癌組織（Z=-3.446，P=0.001，表1），但剔除無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性結(jié)直腸癌后，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性結(jié)直腸癌組織與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織的表達(dá)差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.785，P=0.188，表2）。

2.3 SNAI1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)分析 雙變量相關(guān)分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與SNAI1的表達(dá)呈顯相關(guān)（Kendall’s tau-b 相關(guān)系數(shù)r=0.209＜0.5，P=0.01；Spearman’s 相關(guān)系數(shù)r=0.221＜0.5，P=0.009）。

圖1 SNAI1在不同組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of SNAI in different tissues(SP, ×200)

表1 SNAI1在正常結(jié)直腸組織、結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)情況Tab.1 Expression of SNAI in normal colorectal epithelium, colorectal carcinoma and lymph node metastases

表2 SNAI1在高、中、低分化癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的對(duì)比表達(dá)情況Tab.2 Comparison of SNAI1 in well, moderately, poorly differentiated carcinoma and paired lymphatic metastasis

3 討 論

SNAI1是鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，這個(gè)家族成員還有E12/E47、ZEBl、SIPl和Slug等，其家族具有相似的結(jié)構(gòu)，由一個(gè)高度保守的羧基末端及一個(gè)高度可變的氨基末端構(gòu)成，其家族成員結(jié)構(gòu)上的差異主要表現(xiàn)在中間P-S富集區(qū)域［3］。SNAI1是一個(gè)能誘導(dǎo)EMT的鋅指轉(zhuǎn)錄因子［4］，可以促進(jìn)癌細(xì)胞在早期發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。SNAI1在上皮細(xì)胞的表達(dá)能促進(jìn)在基因表達(dá)層面的成纖維表型的出現(xiàn)，這種表型具有侵襲和遷移的潛能和特性［6］。 最重要的是，SNAI1能夠直接抑制E-cadherin的表達(dá)，而E-cadherin是負(fù)責(zé)細(xì)胞上皮表型如細(xì)胞極性、細(xì)胞和基質(zhì)的黏附能力的主要成分［7］。SNAI1通過與E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域的E-box結(jié)合，直接抑制E-cadherin表達(dá)，破壞上皮細(xì)胞之間的連接，使癌細(xì)胞松散，易于發(fā)生遷移，促進(jìn)EMT的發(fā)生，與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)［8］。Larue等［9］描述，在中胚層與神經(jīng)嵴的前體中，SNAI1通過下調(diào)E-cadherin而觸發(fā)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。E-cadherin表達(dá)丟失被認(rèn)為是EMT最顯著的特征［10-11］。EMT是細(xì)胞喪失上皮特征例如細(xì)胞極性，細(xì)胞連接和獲得間質(zhì)特性如增加運(yùn)動(dòng)性的一種形態(tài)學(xué)過程［12］。它最初在胚胎發(fā)育過程中如原腸胚形成階段，腎器官發(fā)育及神經(jīng)嵴形成中被描述［13］，大量的研究表明EMT被認(rèn)為是腫瘤演進(jìn)及轉(zhuǎn)移的基本過程，是良性腫瘤向高侵襲性腫瘤轉(zhuǎn)換所必需的過程［14］。由此可以看出，SNAI1確實(shí)是腫瘤惡性的標(biāo)志。在本研究中，免疫組化結(jié)果顯示，SNAI1在正常結(jié)直腸黏膜、原發(fā)癌灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)明顯不同，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的表達(dá)最強(qiáng)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，SNAI1在原發(fā)性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)（P＜0.05）；低分化癌組織的表達(dá)顯著高于高中分化癌組織（P＜0.05），SNAI1在Dukes A+B與Dukes C+D分期中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），且雙變量相關(guān)分析顯示組織類別與SNAI1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r＞0.5，P＜0.05），相關(guān)關(guān)系非常密切。據(jù)此推斷，SNAI1可以作為結(jié)直腸癌惡性程度的評(píng)估指標(biāo)。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織的表達(dá)顯著高于原發(fā)性結(jié)直腸癌組織 （P＜0.05），這個(gè)結(jié)果與高維哲等［15］的研究結(jié)果一致。但剔除無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性結(jié)直腸癌病例后，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性結(jié)直腸癌組織與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織的表達(dá)差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。我們認(rèn)為，這種將來自同一個(gè)患者的原發(fā)癌灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌進(jìn)行比較的方法更具可比性和嚴(yán)謹(jǐn)性。我們由此推測(cè)，在結(jié)直腸癌中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的癌細(xì)胞惡性程度并不比原發(fā)癌灶的強(qiáng)，但這需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)方面的研究。

我們將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和SNAI1這兩個(gè)變量進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)兩者顯著正相關(guān)（P＜0.05），即SNAI1表達(dá)水平越高則淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移概率也越大。根據(jù)以往研究［15］，在結(jié)直腸癌中，SNAI1表達(dá)弱者轉(zhuǎn)移的發(fā)生率低，表達(dá)強(qiáng)者其轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。出現(xiàn)這種聯(lián)系的原因應(yīng)該是SNAI1通過直接抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT，使癌細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移能力［8］。綜上所述，我們認(rèn)為在臨床中，通過檢測(cè)結(jié)直腸癌的SNAI1水平，可能可以作為患者是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

SNAI1 在結(jié)直腸癌中表達(dá)與EMT及轉(zhuǎn)移等關(guān)系的分子生物學(xué)機(jī)制已經(jīng)有報(bào)道［8，16-17］。另外，有研究指出拮抗SNAI1作用逆轉(zhuǎn)調(diào)控EMT及腫瘤的體外轉(zhuǎn)移潛能［18］。在此基礎(chǔ)上有望尋找出一種結(jié)直腸癌防治的新方法。

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