HIF-1α和VEGF在胃癌中的表達(dá)及臨床意義

李國(guó)元 趙久達(dá) 王成 趙海燕 趙君慧 耿排力 竇拉加

青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810001

胃癌是常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)占我國(guó)消化道惡性腫瘤的第一位，其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素［1］。大多數(shù)研究表明胃癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是多基因及其蛋白表達(dá)產(chǎn)物協(xié)調(diào)作用的結(jié)果［2］。本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表達(dá)情況，并研究其與臨床病理特征的關(guān)系，分析兩種蛋白在胃癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，為判斷預(yù)后及指導(dǎo)臨床治療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科2007年7月—2009年5月手術(shù)全切除或次全切除的胃癌標(biāo)本及其配對(duì)的距癌灶5 cm以上的癌旁組織標(biāo)本各85例，標(biāo)本均經(jīng)組織病理確診；患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療。其中男性49例，女性36例，年齡35～76歲，中位年齡56歲。胃癌患者臨床分期按2003年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）頒布的胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期47例，Ⅳ期16例。胃癌分化程度：高分化腺癌11例，中分化腺癌18例，低分化腺癌39例，未分化癌 17例。胃癌浸潤(rùn)深度：浸潤(rùn)達(dá)漿膜層者62例，浸潤(rùn)未達(dá)漿膜層者23例。胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者68例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者17例。

1.2 主要試劑 鼠抗人HIF-1α、VEGF單克隆抗體及其他相關(guān)試劑購(gòu)于福州邁新公司。

1.3 檢測(cè)方法 采用免疫組織化學(xué)SP法。石蠟包埋的組織4 μm連續(xù)切片；二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化；3%過(guò)氧化物消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；EDTA修復(fù)；正常羊血清室溫下封閉；加入即用型一抗（鼠抗人HIF-1α單抗，鼠抗人VEGF單抗）4 ℃冰箱過(guò)夜；PBS清洗，加入二抗，溫育0.5 h，沖洗后DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判斷 由病理科?？漆t(yī)生獨(dú)立閱片，對(duì)照HE染色確定腫瘤細(xì)胞區(qū)域，于顯微鏡下觀察，每例觀察2張切片，每張切片任意觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。HIF-1α的結(jié)果判斷按照腫瘤細(xì)胞的染色比例分級(jí)。以伴或不伴胞質(zhì)染色的細(xì)胞核染色為陽(yáng)性計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)［3］，（-）：沒有染色或＜1%的細(xì)胞核染色；（+）：1%～10%的細(xì)胞核染色，和（或）較弱的胞質(zhì)染色；（++）：10%～＜50%的細(xì)胞核染色，和（或）明顯的胞質(zhì)染色；（+++）：≥50%的細(xì)胞核染色，和（或）較強(qiáng)的胞質(zhì)染色。（-）為陰性；（+）～（+++）為陽(yáng)性。VEGF的結(jié)果判斷［4］按照腫瘤細(xì)胞的染色比例分級(jí)，胞質(zhì)染色情況為陽(yáng)性計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，我們認(rèn)為＜10%的胞質(zhì)染色為陰性表達(dá)；≥10%為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織與癌旁組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)及比較 在所測(cè)85例胃癌組織中，HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)主要在細(xì)胞核，部分胞質(zhì)中也可見陽(yáng)性表達(dá)，胃癌壞死區(qū)和胃癌浸潤(rùn)邊緣的細(xì)胞核表達(dá)最明顯（圖1）。VEGF主要表達(dá)在胃癌細(xì)胞的胞質(zhì)中（圖2）。檢測(cè)出HIF-1α和VEGF的表達(dá)陽(yáng)性率分別為76.47%（65/85）和60.00%（51/85）；所測(cè)85例癌旁組織中HIF-1α和VEGF全部為陰性表達(dá)（0/85），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 胃癌組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 85例胃癌中HIF-1α和VEGF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)在不同組織學(xué)分型中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但不同臨床分期、浸潤(rùn)程度和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌標(biāo)本中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）（P＜0.05）。

圖1 免疫組化SP法檢測(cè)HIF-1α在胃癌中的表達(dá)Fig.1 The expression of HIF-1 in gastric cancer by immunohistochemical SP method(×400)

圖2 免疫組化SP法檢測(cè)VEGF在胃癌中的表達(dá)Fig.2 The expression of VEGF in gastric cancer by immunohistochemical SP method(×400)

2.3 胃癌組織中HIF-1與VEGF蛋白表達(dá)之間的關(guān)系 由表2可見，85例胃癌中，HIF-1α與VEGF同為陽(yáng)性者45例，同為陰性者14例，兩者之間呈顯著相關(guān)（r=0.367，P＜0.05）。

表1 HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between expressions of HIF-1α, VEGF and clinical parameters of gastric carcinoma

表2 HIF-1α與VEGF蛋白在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析Tab.2 The correlation between HIF-1α and VEGF in gastric carcinoma

3 討 論

低氧是惡性腫瘤快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的普遍現(xiàn)象，目前被證實(shí)的低氧誘導(dǎo)基因的數(shù)量愈來(lái)愈多。HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)產(chǎn)生的一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。HIF-1主要由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞單位組成，其中HIF-1α是唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位，它決定HIF-1的活性［5］，其靶基因涉及腫瘤細(xì)胞能量代謝、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等，VEGF即是其中的靶基因之一。許多惡性腫瘤的局部生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于血管新生，這需要血管生成因子如VEGF、FGF、PDGF和IL-8的產(chǎn)生和分泌。VEGF能以自分泌及旁分泌形式刺激腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，是誘導(dǎo)腫瘤血管形成作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長(zhǎng)因子，也是一組促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的多功能細(xì)胞因子，HIF-1α與VEGF在腫瘤研究中的作用和地位日益受到重視。

Ryan等［6］通過(guò)免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，在良性腫瘤組織中，HIF-1α表達(dá)處于正常水平；在許多原發(fā)性惡性腫瘤中HIF-1α表達(dá)升高，而在轉(zhuǎn)移性腫瘤中 HIF-1α表達(dá)升高更加顯著。Zhong等［3］分析了179例不同類型腫瘤標(biāo)本中HIF-1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在包括前列腺癌、乳腺癌和胃癌等13種腫瘤中可見HIF-1α呈不同程度的表達(dá)，而在相應(yīng)的良性腫瘤中沒有檢測(cè)到HIF-1α，其中2例胃癌均有表達(dá)HIF-1α。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在用免疫組化方法檢測(cè)85例胃癌組織中HIF-1α的表達(dá)水平時(shí)，65例為陽(yáng)性表達(dá)，20例為陰性表達(dá)，表達(dá)陽(yáng)性率為76.47%，與癌旁組織全部陰性表達(dá)相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說(shuō)明HIF-1α的在胃癌中的過(guò)度表達(dá)對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展可能有一定的意義。

關(guān)于HIF-1α在腫瘤中的表達(dá)與腫瘤臨床病理因素的關(guān)系，各家的研究結(jié)果不盡相同，主要集中在HIF-1α的表達(dá)與腫瘤分化程度的關(guān)系上。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HIF-1α在胃癌TNM Ⅰ/Ⅱ 和Ⅲ/Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為40.91%和88.89%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著胃癌浸潤(rùn)深度的加深，HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率也明顯增加（52.17%vs 85.48%），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率為83.82%，顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組的47.06%（P＜0.05），但HIF-1α的表達(dá)與胃癌的分化程度無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05）。Kurokawa等［7］利用單克隆抗體采用免疫組化方法檢測(cè)130例食管鱗癌手術(shù)切除標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，其中40例HIF-1α高表達(dá)，且與腫瘤TNM分級(jí)、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移正相關(guān)，但與腫瘤分化程度無(wú)關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。這表明HIF-1α過(guò)度表達(dá)可反映胃癌的生物學(xué)行為，可能成為判斷胃癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的有價(jià)值指標(biāo)。

VEGF免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：VEGF的表達(dá)在胃癌分化程度間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），VEGF在胃癌組織中的總陽(yáng)性率為60.00%（51/85），表明 VEGF的過(guò)度表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；胃癌浸潤(rùn)深度不同，VEGF的表達(dá)明顯不同，浸潤(rùn)深度為未達(dá)漿膜者的陽(yáng)性率（26.09%）明顯低于達(dá)漿膜者（72.58%）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其VEGF表達(dá)陽(yáng)性率為69.12%明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的23.53%；隨著臨床TNM分期增加，VEGF在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率亦明顯增加，Ⅲ/Ⅳ期的陽(yáng)性率為74.16%，而Ⅰ/Ⅱ期的陽(yáng)性率僅為18.18%；在Ⅰ/Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Onogawa等［8］研究發(fā)現(xiàn)，VEGF表達(dá)與胃癌漿膜浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但王天寶等［9］的研究提示VEGF-C的表達(dá)與胃癌分化、分期及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：隨著胃癌逐漸發(fā)展，VEGF表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且與胃癌TNM分級(jí)、胃癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，說(shuō)明檢測(cè)胃癌VEGF的表達(dá)水平可以作為判斷胃癌生物學(xué)行為的參考指標(biāo)。

Cabuk等［10］的研究報(bào)道顯示，HIF-1α和VEGF在胃癌中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為71%和65%，HIF-1α和VEGF表達(dá)陽(yáng)性率有明顯相關(guān)性，患者5年總生存率為45%，但HIF-1α、VEGF表達(dá)及其他病理特征對(duì)患者生存率沒有影響。本研究資料顯示，85例胃癌組織中HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表達(dá)共同陽(yáng)性者為45例，HIF-1α陽(yáng)性而VEGF陰性者為20例，VEGF陽(yáng)性而HIF-1α陰性者為6例，共同陰性者為14例，經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者具有正相關(guān)性。這提示HIF-1α與VEGF存在著調(diào)控關(guān)系，HIF-1α/VEGF通路在調(diào)節(jié)胃癌新生血管生成過(guò)程中具有十分重要的作用，兩者在胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能具有協(xié)同作用。另有研究證實(shí)，HIF-1α不僅可促進(jìn)VEGF的轉(zhuǎn)錄，而且可增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤新生血管生成，而VEGF mRNA穩(wěn)定性增加對(duì)VEGF蛋白表達(dá)的上調(diào)也有促進(jìn)作用［11］。Kim等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中HIF-1α mRNA的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期及3年內(nèi)的復(fù)發(fā)有明顯相關(guān)，而VEGF mRNA只與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平之間有明顯的相關(guān)性。

綜上所述，HIF-1α和VEGF在胃癌組織中高表達(dá)，并與胃癌的臨床TNM分期、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，HIF-1α的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)。由此我們認(rèn)為HIF-1α和VEGF共同參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，HIF-1α可能通過(guò)上調(diào)VEGF的蛋白表達(dá)促進(jìn)胃癌血管生成進(jìn)而促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移，它們?cè)谖赴┭苌珊蜕L(zhǎng)侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有相互疊加或協(xié)同作用。針對(duì)HIF-1α和VEGF靶點(diǎn)治療胃癌可能是將來(lái)的一種方向，但有關(guān)HIF-1α和VEGF對(duì)腫瘤患者生存方面的影響應(yīng)行進(jìn)一步研究。

致謝：感謝羅翠松碩士對(duì)本課題所作的工作。

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