miR-21對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響

吳子晏 劉小云 楊述華

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430022

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，廣泛存在于植物和動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，包括調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡［1-2］。其中miR-21是唯一一個(gè)在9種人類腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的小RNA分子［3-7］，其在腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制逐漸被闡明。但是miR-21在骨肉瘤細(xì)胞中的促癌作用鮮有報(bào)道，在本實(shí)驗(yàn)中我們采用反義寡核酸技術(shù)（antisense oligonucleotide，ASO）抑制miR-21在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，分析miR-21對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響。

1 資料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科2009年手術(shù)切除的8例骨肉瘤組織和4例正常骨組織。所有患者術(shù)前均未行放化療。

1.1.2 細(xì)胞株和主要試劑 MG-63細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司，miR-21 ASO（5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAG CUA-3’）和對(duì)照ASO（5’-UAGCUUAUCAGA CUGAUGUUGA-3’）購(gòu)自上海GenePharma公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000和OPTI MEMI購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，TaqMan miRNA Isolation Kit，TaqMan microRNA Assay 和the TaqMan Universal PCR Master Mix均購(gòu)于加拿大Applied Biosystems公司，SYBR Green Real time PCR Master Mix購(gòu)自 Toyobo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染 用含

10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MG-63細(xì)胞。反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染依試劑說(shuō)明操作。采用不含血清的OPTI MEMI培養(yǎng)基分別稀釋miR-21 ASO和對(duì)照組ASO，然后取脂質(zhì)體LipofectamineTM2000稀釋到OPTI MEMI培養(yǎng)基中，輕輕混勻后在室溫下溫育5 min，再將稀釋的LipofectamineTM2000分別與稀釋的miR-21 ASO和對(duì)照組ASO混合，輕輕混勻后在室溫下溫育20 min，以形成復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含細(xì)胞的培養(yǎng)板中混合，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)，5 h后更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 miR-21的檢測(cè) 體外培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染miR-21 ASO 和對(duì)照ASO，以TaqMan miRNA分離試劑盒提取小RNA，采用TaqMan microRNA Assay和TaqMan Universal PCR Master Mix來(lái)檢測(cè)成熟miR-21的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參基因。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MG-63細(xì)胞的增殖MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，接種于平底6孔培養(yǎng)板中，500個(gè)細(xì)胞/孔，置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2～3周。經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇5 mL，固定15 min。然后去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 MTT法觀察MG-63細(xì)胞增殖抑制情況 收集轉(zhuǎn)染后的MG-63細(xì)胞分別接種于96孔板中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)72 h后，每孔加50 μL MTT溶液（5 mg/mL），置入孵箱溫育4 h，吸出上清液，每孔加150 μL DMSO，用平板床搖勻。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度值（A）。抑制率=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組）×100%。

1.2.5 在體檢測(cè)miR-21 ASO對(duì)MG-63細(xì)胞增殖的影響 18只4～5周齡大小的裸鼠購(gòu)于上海斯萊克公司，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。在MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 ASO或?qū)φ誂SO后，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞，制成200 μL（5×106個(gè)）單細(xì)胞懸液，注射于小鼠右側(cè)腋下。腫瘤形成后每日用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的直徑，根據(jù)參考文獻(xiàn)［8］中的方法來(lái)計(jì)算腫瘤的體積（V=D×d2×π/6）（D，d分別代表腫瘤的最大直徑和最小直徑），并繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線。6周后裸鼠處死取瘤稱重。4%甲醛固定腫瘤組織，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察腫瘤組織的病理學(xué)改變。

1.2.6 離體檢測(cè)miR-21 ASO對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的影響 采用Annexin V法，分別收集miR-21 ASO或?qū)φ誂SO轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞，以PBS重懸細(xì)胞。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7 各組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)采用Western blot方法，在miR-21 ASO或?qū)φ誂SO轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞培養(yǎng)至80%鋪底時(shí)，收集待檢測(cè)細(xì)胞，提取總蛋白，10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，將膜放在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中37 ℃封閉2 h，加入用TBST1∶1 000稀釋的鼠抗人Bcl-2單克隆抗體4 ℃溫育過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG（1∶1 000稀釋），37 ℃溫育2 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)條帶。以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.8 各組細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 各組細(xì)胞通過(guò)加入TRIzol裂解液提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，利用SYBR Green Real Time PCR Master Mix通過(guò)realtime PCR來(lái)檢測(cè)Bcl-2，其序列［9］：Bcl-2，5’-AACTGGGG GAGGATTGTGGC-3’和5’-GATCCAGGTGTGCAGGTGCC-3’。反應(yīng)條件：94 ℃變性1 min，58 ℃擴(kuò)增45 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。β-actin作為一個(gè)內(nèi)參照。PCR反應(yīng)在ABI7300反應(yīng)平臺(tái)上進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均在SPSS 13.0軟件上進(jìn)行，結(jié)果以±s 表示，兩組間均數(shù)的比較采用Student’s t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-21在骨肉瘤和正常骨組織中的表達(dá)通過(guò)qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)miR-21在8例骨肉瘤和4例正常骨組織中都有表達(dá)，且在骨肉瘤中的表達(dá)明顯高于正常骨組織，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017，圖1）。

圖1 8例骨肉瘤和4例正常骨組織中miR-21的相對(duì)表達(dá)Fig.1 Relative expression of miR-21 in 8 osteosarcoma tissues and 4 normal bone tissues

2.2 miR-21 ASO對(duì)MG-63細(xì)胞miR-21表達(dá)和對(duì)細(xì)胞存活率的影響 轉(zhuǎn)染miR-21 ASO后，通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)較對(duì)照顯著降低（P=0.003）。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-21 ASO后，MG-63細(xì)胞存活數(shù)明顯低于對(duì)照組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023）。

2.3 miR-21 ASO對(duì)離體MG-63細(xì)胞增殖的影響 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-21 ASO轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞克隆形成率較對(duì)照明顯降低（P=0.012）。

2.4 miR-21 ASO對(duì)在體MG-63細(xì)胞增殖的影響 在本實(shí)驗(yàn)中，所有的裸鼠腫瘤成瘤率為100%，但是miR-21 ASO轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞所形成的腫瘤生長(zhǎng)較對(duì)照明顯要慢，且無(wú)論是在質(zhì)量（P=0.013）還是體積（P=0.028，圖2）上都和對(duì)照的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)病理組織切片染色證實(shí)所有腫瘤均為骨肉瘤組織（圖3）。

圖2 在體miR-21 ASO轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞所形成腫瘤的體積變化Fig.2 Tumor growth curves after transfection of miR-21 ASO

圖3 腫瘤組織HE染色Fig.3 HE staining of tumor tissues(×200)

2.5 miR-21 ASO對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，MG-63細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-21 ASO后，凋亡增加明顯，而對(duì)照ASO轉(zhuǎn)染后凋亡無(wú)明顯變化（P=0.022，圖4）。

2.6 各組細(xì)胞Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，miR-21 ASO轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照ASO轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019，圖5）。但是兩組之間的Bcl-2 mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-21 ASO轉(zhuǎn)染后的MG-63細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis in MG-63 cells after transfection of miR-21 ASO

圖5 Bcl-2蛋白在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.5 Bcl-2 protein level in MG-63 cells after transfection of miR-21 ASO detected by Western blot

3 討 論

miRNA是新近證明的一類長(zhǎng)約20～25 nt的內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，在多個(gè)物種中廣泛存在，包括動(dòng)物、植物和病毒。目前，被證實(shí)的小RNA就有500多種，而計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)可能會(huì)超過(guò)1 000個(gè)，且約1/3的人類基因被小RNA調(diào)控。miRNA主要通過(guò)與目標(biāo)mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域特異結(jié)合來(lái)抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后的翻譯。大量研究表明，miRNA在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平異常，是影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要因素，故成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)了臨床上收集的骨肉瘤標(biāo)本和正常骨組織，結(jié)果顯示miR-21在腫瘤組織中呈明顯高表達(dá)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與以前的一些研究結(jié)果相似［3-7］，表明了miR-21在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起了促癌作用。

目前，有研究利用針對(duì)目的miRNA的ASO來(lái)研究各種miRNA在細(xì)胞中的生物學(xué)功能［10-11］。為了驗(yàn)證miR-21對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響，在本研究中我們通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-21 ASO來(lái)降低miR-21在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)我們用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-21 ASO后MG-63細(xì)胞存活率的變化情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-21 ASO的MG-63細(xì)胞存活率明顯降低。進(jìn)一步在克隆形成實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-21 ASO后，MG-63細(xì)胞克隆形成率比對(duì)照顯著減少。而且在體實(shí)驗(yàn)也觀察到轉(zhuǎn)染miR-21 ASO后，MG-63細(xì)胞皮下形成腫瘤的體積和數(shù)目也減小，相對(duì)于對(duì)照來(lái)看兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些說(shuō)明了miR-21在骨肉瘤細(xì)胞的增殖中發(fā)揮著重要作用，miR-21 ASO抑制腫瘤細(xì)胞增殖是有效的。Si等［12］在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21 ASO后，通過(guò)在體和離體實(shí)驗(yàn)也都證實(shí)腫瘤細(xì)胞增殖能力明顯被抑制。

為研究miR-21 ASO對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響，在轉(zhuǎn)染miR-21 ASO后，我們利用Annexin V來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-21 ASO的MG-63細(xì)胞凋亡明顯增加。Bcl-2即細(xì)胞凋亡抑制基因，是目前發(fā)現(xiàn)的與凋亡關(guān)系密切相關(guān)的基因之一。為證實(shí)miR-21與Bcl-2是否也存在一定程度上的聯(lián)系，我們通過(guò)檢測(cè)Bcl-2蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-21 ASO的MG-63細(xì)胞Bcl-2蛋白水平明顯降低，而B(niǎo)cl-2 mRNA水平無(wú)明顯的改變，說(shuō)明miR-21主要可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制Bcl-2的表達(dá)。而miR-21影響腫瘤細(xì)胞增殖也可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的調(diào)控。綜上所述，miR-21有調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力，利用ASO可能成為基因治療骨肉瘤的一個(gè)新的研究方向。但是miR-21不是骨肉瘤中唯一異常表達(dá)的小RNA分子，所以應(yīng)該找出更多異常表達(dá)的小RNA分子，發(fā)現(xiàn)它們之間的聯(lián)系，為更好地理解骨肉瘤的發(fā)生機(jī)制及骨肉瘤的基因治療提供更好的理論支持。

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