替硝唑注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的可行性研究

焦小麗 黃新蘭* 季紅蘭 陳琴華

江蘇省揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司（225321）

替硝唑注射液為抗厭氧菌及滅滴蟲藥，臨床主要用于治療滴蟲、腸及腸外阿米巴病、賈第蟲病和厭氧菌感染。替硝唑注射液在《中國藥典》2005 版中采用家兔法檢查熱原[1]，但家兔法操作繁瑣費(fèi)時(shí)，而且實(shí)驗(yàn)成本高，不適用于注射劑生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)鱟試劑在沒有干擾條件下可以對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的原理，參照《中國藥典》2005 版中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，采用凝膠法鱟試驗(yàn)法，通過干擾實(shí)驗(yàn)確立了替硝唑注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，并與家兔法進(jìn)行對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法準(zhǔn)確可靠、操作方便簡單，可以用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替家兔法控制替硝唑注射液的熱原[2]。

1 儀器與試藥

2H-2型漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；TAL-3A型干式恒溫器（南京三愛斯技術(shù)開發(fā)有限公司）；LC-233B1型高溫干燥箱。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)為150601-200862，120EU/支，中國藥品生物制品檢定所）。鱟試劑（TAL，批號(hào)為0810222，0.25EU/支，0.1mL/支，湛江安度斯生物有限公司；批號(hào)為0809200，0.25EU/支，0.1mL/支，湛江博康海洋生物有限公司）。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號(hào)為0806300，25mL/瓶，湛江安度斯生物有限公司）；熱原合格的替硝唑注射液（規(guī)格：200mL：0.8g，批號(hào)：08090611、08090811、08090911揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)有限公司）。

2 方法與結(jié)果[3-13]

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值L確定

公式L=K/M中L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值；K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑為5EU/(kgh)[1]；M為每小時(shí)內(nèi)每千克體質(zhì)量（人）的最大給藥劑量，或熱原檢查家兔按規(guī)定給藥途徑的給藥劑量，2005年版《中國藥典》規(guī)定家兔劑量為8mL/kg，因此可算得L=5/8=0.625EU/mL。

2.2 最大有效稀釋倍數(shù)的確定

根據(jù)公式MVD=cL/λ，L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，c為供試品溶液的濃度，λ為鱟試劑的標(biāo)示敏感度。2005年版《中國藥典》規(guī)定當(dāng)L以EU/mL表示時(shí)，c為1.0mL/mL。L=0.625EU/mL，λ為0.25EU/mL，則MVD=2.5。

2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET）的質(zhì)量考察

實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素含量＜0.015EU/mL）經(jīng)檢查，在37℃試管恒溫儀中放置4h未與鱟試劑產(chǎn)生凝聚反應(yīng)，符合中國藥典規(guī)定[2]。

2.4 TAL敏感度復(fù)核

所用TAL按2005年版《中國藥典》規(guī)定進(jìn)行敏感度復(fù)核。結(jié)果均在0.5～2λ，符合規(guī)定，故可用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

2.5 干擾預(yù)試驗(yàn)

選用λ=0.25EU/mL的TAL，以原液作為基準(zhǔn)，用BET水對(duì)樣品進(jìn)行倍比稀釋，得樣品的稀釋倍數(shù)系列（即原液，1∶2、1∶4、1∶8、1∶16），以此系列為NC系列。PC系列：用原液和供試品各稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成與上述NC系列相同的稀釋倍數(shù)系列，但在稀釋過程中每稀釋倍數(shù)中都會(huì)有2λ內(nèi)毒素。選擇兩個(gè)廠家的標(biāo)示量為0.25EU/mL的TAL，使之分別與上述兩個(gè)系列反應(yīng)，同時(shí)作陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：樣品溶液稀釋倍數(shù)在1∶2以下時(shí)不干擾試驗(yàn)。

2.6 干擾試驗(yàn)

采用兩個(gè)廠家0.25EU/mL的TAL，用替硝唑液注射液的1∶2稀釋液和BET水將同一細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品分別制成2.0、1.0、0.5、0.25λ的系列濃度溶液，考察本品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的干擾情況，結(jié)果見表2。Es值在0.5～2.0λ，且Et值在0.5Es～2.0Es，說明此時(shí)樣品稀釋對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾。

表1 供試品干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表2 供試品的干擾試驗(yàn)結(jié)果

表3 3批替硝唑注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

2.7 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

按2005年版《中國藥典（二部）》附錄規(guī)定的方法，對(duì)3批樣品按1∶2稀釋后，以λ為0.25EU/mL的TAL進(jìn)行常規(guī)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，3批替硝唑注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素均小于0.5EU/mL，與熱原法結(jié)果一致。

3 討 論

本試驗(yàn)采用不同廠家的TAL對(duì)3個(gè)批號(hào)樣品進(jìn)行凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果符合2005年版《中國藥典》附錄有關(guān)規(guī)定，排除了采用了不同廠家TAL對(duì)本試驗(yàn)帶來的影響，且供試品用熱原檢查法檢測也均符合規(guī)定。因此，可認(rèn)為用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢測替硝唑注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的，并可確定其細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.5EU/mL。

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