喹硫平對小鼠腦缺血后膠質(zhì)增生及IL-1β表達(dá)作用的實驗研究

房紹寬, 白 晶, 周春奎, 吳 江

急性缺血性卒中具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點,給社會家庭帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)[1]。腦缺血的臨床表現(xiàn)不僅包括運動、感覺、視覺功能障礙,也包括遺忘、忽略等,而且常伴有情緒紊亂、抑郁焦慮及精神癥狀,這些均抑制腦缺血后生理和認(rèn)知功能的恢復(fù)[2～7]。近幾年,很多證據(jù)表明一些非典型抗精神失常藥具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究以小鼠腦缺血為模型研究非典型抗精神病藥喹硫平是否對腦缺血具有保護(hù)作用,從而為深入研究非典型抗精神病藥的神經(jīng)保護(hù)作用的機制及對腦缺血的治療提供有意義的資料。目前關(guān)于腦缺血后神經(jīng)保護(hù)的研究較多,但喹硫平對腦缺血后膠質(zhì)細(xì)胞增生及 IL-1β表達(dá)水平的影響還不清楚。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性 ICR小鼠(Charles River,St Constant,QC,Canada)46只,實驗開始時重量 18～20克。我們選擇 ICR小鼠是因為它是一個非敏感體質(zhì)的品系,而且經(jīng)受頸總動脈閉塞后,存活率達(dá)到95%。小鼠在正常飲食、正常光照時間,室溫下飼養(yǎng)。

1.2 實驗動物分組(見表1)。

1.3 動物模型制備 用氯胺酮(110mg/kg)和甲苯噻嗪(15mg/kg)麻醉,麻醉后沿正中線切口,分離雙側(cè)總動脈并用棉線阻斷雙側(cè)頸總動脈血流60min,60min后撤掉棉線觀察血管血液復(fù)流,然后縫合正中線切口。假手術(shù)組執(zhí)行相同程序,但不閉塞雙側(cè)的頸總動脈。手術(shù)后用熱毯維持小鼠在正常體溫。

1.4 給藥方法 喹硫平(由英國 Astra Zeneca制藥公司提供)溶于無菌生理鹽水中,根據(jù)先前的實驗[8,9],我們采用喹硫平 10mg/kg,缺血手術(shù)后給予小鼠喹硫平 10mg/kg或鹽水腹腔注射處理,1次/d,共 4w。

1.5 實驗方法 (1)免疫組織化學(xué)方法檢測GFAP和 CD11蛋白質(zhì)表達(dá)：免疫組織化學(xué)方法采用SABC法,應(yīng)用 SABC試劑盒,將組織切片置于 3%H2O2中常溫處理 10min,蒸鎦水洗滌 3次;加入血清封閉液 5min,加入一抗(兔抗 GFAP和 CD11特異性抗體)37℃ 1h,0.01mmol/L PBS洗滌 3次;加入生物素化二抗(羊抗兔 IgG)37℃ 10min,PBS洗 3次;加入 SABC試劑 37℃ 20min,PBS洗滌 4次;DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,脫水封片鏡檢。(2)激光共聚焦顯微鏡檢測 GFAP-IL-1β共表達(dá)：將組織切片在二甲苯中浸 3次,正常山羊血清封閉,分別滴加 50μl的 1∶1混合的兔抗大鼠 GFAP(1∶100)和小鼠抗大鼠 IL-1β(1∶200),設(shè)空白對照(無一抗,加 PBS)和抗體特異性對照(加一抗不加二抗,加二抗不加一抗),所有切片同時染色。切片一抗加入后,置于濕盒內(nèi),4℃,過夜。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

表1 實驗動物分組

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 缺血組與假手術(shù)組相比較,腦缺血再灌后 2h GFAP免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯變化;缺血組與假手術(shù)組相比較,腦缺血再灌后 2d和 4d GFAP免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量增加(P＜0.05);藥物保護(hù)組與缺血組比較GFAP免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯變化;缺血組與假手術(shù)組相比較,腦缺血再灌后 8d、2w和 4w,GFAP免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量增加(P＜0.05);藥物保護(hù)組與缺血組比較 GFAP免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。CD11是活化的小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志,我們應(yīng)用免疫組化的方法檢測腦缺血及給予喹硫平后海馬齒狀回內(nèi) CD11陽性細(xì)胞表達(dá),借以分析海馬齒狀回內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況及喹硫平對腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。缺血組與假手術(shù)組相比較,腦缺血再灌后 2h、2d和 4d,CD11免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量增加(P＜0.05);藥物保護(hù)組與缺血組比較各時間點 CD11免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯變化。

2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果 缺血組與假手術(shù)組相比較,腦缺血再灌后 4w,GFAP-IL-1β共表達(dá)陽性細(xì)胞(黃色)數(shù)量明顯增加(P＜0.01);藥物保護(hù)組與缺血組比較,GFAP-IL-1β共表達(dá)陽性細(xì)胞(黃色)數(shù)量明顯減少(P＜0.01)。

3 討 論

腦血管疾病是危害人類生命與健康的常見病和多發(fā)病,是人類 3大死亡原因之一,其中缺血性腦血管病占很大的比例。

腦缺血后反應(yīng)性的膠質(zhì)增生活化包括早期的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和后繼的星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化。在正常生理情況下,小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài),分布于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。當(dāng)腦部受到損傷或有病原體入侵時,小膠質(zhì)細(xì)胞遷徙到病變部位并發(fā)生一系列結(jié)構(gòu)和功能的變化,發(fā)揮吞噬細(xì)胞的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持神經(jīng)元正?；钚苑矫姘l(fā)揮幾項重要作用,包括谷氨酸的攝取和釋放、鉀離子及氫離子的平衡緩沖以及水的轉(zhuǎn)運。但過度增生活化的膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放有害因子如腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素、干擾素[10]等導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(DND)。過度增殖的膠質(zhì)細(xì)胞尤其是膠質(zhì)疤痕的形成不僅可影響到神經(jīng)元軸突的生長、突觸的重建及阻斷腦組織微循環(huán)[11],而且還是腦血管病后癲癇發(fā)病的根源,因此膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元的作用具有利弊雙重性。抑制腦缺血后過度的膠質(zhì)細(xì)胞增生及 IL-1β的表達(dá)成為腦缺血后神經(jīng)功能重建目標(biāo)的重要途徑之一。近幾年,很多證據(jù)表明一些非典型抗精神失常藥具有神經(jīng)保護(hù)作用?；A(chǔ)實驗證明非典型抗精神失常藥喹硫平可有效緩解 MPP+、H2O2及 β淀粉樣肽等由于氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的 PC12細(xì)胞死亡[12,13]。這些神經(jīng)保護(hù)作用的機制包括影響 Bax/Bcl-xl的轉(zhuǎn)位和表達(dá)或 SOD-1的上調(diào)[14～16]。先前的動物實驗結(jié)果表明喹硫平能有效緩解慢性應(yīng)激所導(dǎo)致的海馬 BDNF和細(xì)胞增生的縮減[17,18],而且喹硫平能有效緩解安非他明所誘導(dǎo)的行為學(xué)改變和對多巴胺神經(jīng)末梢的毒性作用[19]。喹硫平在改善腦缺血后精神癥狀同時也能夠減輕腦缺血后認(rèn)知功能的損傷[20]。

我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)CCAO(common carotid artery occlusion,頸總動脈閉塞)能阻斷 85%的腦血流并足以誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)元損傷而且死亡率僅有 5%。經(jīng)過我們對 30、60、90min CCAO模型的初步研究,發(fā)現(xiàn) 60min CCAO在小鼠模型中產(chǎn)生明顯的急性神經(jīng)變性和記憶損傷[21,22]。因此本研究中,我們采用了60min CCAO模型。GFAP(Glial fibrillary acidic protein,膠質(zhì)纖維酸性蛋白)是星形膠質(zhì)細(xì)胞中絲蛋白的主要組成部分,其表達(dá)量的增加通常被作為星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后活化和增殖的標(biāo)志。我們應(yīng)用免疫組化的方法檢測腦缺血及給予喹硫平后海馬齒狀回內(nèi) GFAP陽性細(xì)胞表達(dá),借以分析腦缺血后海馬齒狀回內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖情況及喹硫平對腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。采用激光共聚焦顯微鏡觀察方法評價腦缺血后的炎癥反應(yīng)及喹硫平對腦缺血后炎癥反應(yīng)的作用。

本研究顯示腦缺血再灌后 2d、4d、8d、2w和 4w時 GFAP免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量增加,腦缺血再灌后 8d、2w和 4w時喹硫平減少 GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖;腦缺血再灌后 2h、2d和 4d時 CD11免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量增加,喹硫平對 CD11的表達(dá)沒有影響。缺血再灌后 4w時GFAP-IL-1β共表達(dá)增加,而喹硫平減少 GFAP-IL-1β的共表達(dá)。本研究結(jié)果提示我們非典型抗精神失常藥物喹硫平能夠減輕腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度增生和活化,同時降低 IL-1β的表達(dá)水平為治療缺血性腦損傷所伴發(fā)的精神紊亂提供新途徑。

[1]Taylor TN,Davis PH,Torner JC,etal.Life time cost of stroke in the United States[J].Stroke,1996,27(9)：1459-1466.

[2]Bokura H,Robinson RG.Long-term cognitive impairment associated with caudate stroke[J].Stroke,1997,28：970-975.

[3]Bradvik B,Sonesson B,Holtas S.Spatial impairment following right hemisphere transient ischaem ic attacks in patientswithout carotid artery stenosis[J].Acta Neurol Scand,1989,80：411-418.

[4]Chemerinski E,Levine SR.Neuropsychiatric disorders following vascular brain injury[J].Mt Sinai JMed,2006,73：1006-1014.

[5]Desmond DW,Moroney JT,Sano M,etal.Incidence of dementia after ischemic stroke：resultsofa longitudinalstudy[J].Stroke,2002,33：2254-2260.

[6]Desmond DW,Moroney JT,Sano M,etal.Mortality in patients with dementia after ischem ic stroke[J].Neurology,2002,59：537-543.

[7]Williams LS,Ghose SS,Swindle RW.Depression and other mental health diagnoses increasemortality risk after ischem ic stroke[J].Am JPsychiatry,2004,161：1090-1095.

[8]Xu H,Qing H,Lu W,etal.Quetiapine attenuates the immobilization stress-induced decrease of brain-derived neurotrophic factor expression in rat hippocampus[J].Neurosci Lett,2002,321(1～ 2)：65-68.

[9]He J,Xu H,Yang Y,etal.Chronic administration of quetiapine alleviates the anxiety-like behavioural changes induced by a neurotoxic regimen of dl-amphetam ine in rats[J].Behav Brain Res,2005,160(1)：178-187.

[10]Lasser RA,Sunderland T.Newer psychotropic medication use in nursing home residents[J].JAm Geriatr Soc,1998,46：202-207.

[11]Sorensen L,Foldspang A,Gulmann NC,etal.Determinants for the use of psychotropicsamongnursing home residents[J].Int JGeriatr Psychiatry,2001,16：147-154.

[12]Wei Z,Bai O,Richardson JS,etal.Olanzapine protects PC 12 cells from oxidative stress induced by hydrogen peroxide[J].JNeurosci Res,2003,73：364-368.

[13]Wei Z,Mousseau DD,Richardson JS,etal.Atypical antipsychotics attenuate neurotoxicity of beta-amyloid(25-35)by modulating Bax and Bcl-XL/S expression and localization[J].J Neurosci Res,2003,74：942-947.

[14]Li XM,Chlan-Fourney J,Juorio AV,etal.Differential effects of olanzapine on the gene expression of superoxide ismutase and low affinity nerve growth factor receptor[J].JNeurosci Res,1999,56：72-75.

[15]Qing H,Xu H,Wei Z,etal.The ability of atypical antipsychotic drugs versus haloperidol to protect PC12 cells against MPP+-induced apoptosis[J].Eur JNeurosci,2003,17：1563-1570.

[16]Wei Z,Bai O,Richardson JS,etal.Olanzapine protects PC 12 cells from oxidative stress induced by hydrogen peroxide[J].JNeurosci Res,2003,73：364-368.

[17]Xu H,Chen Z,He J,etal.Synergetic effectsof quetiapine and venlafaxine in preventing the chronic restraint stress-induced decrease in cell proliferation and BDNF expression in rat hippocampus[J].Hippocampus,2006,16：551-559.

[18]Xu H,Qing H,LuW,etal.Quetiapine attenuates the immobilization stress-induced decrease of brain derived neurotrophic factor expression in rat hippocampus[J].Neurosci Lett,2002,321：65-68.

[19]He J,Xu H,YangY,etal.Chronic adm inistration ofquetiapine alleviates the anxiety-like behavioural changes induced by a neurotoxic regimen of d,l-amphetam ine in rats[J].Behav Brain Res,2005,160：178-87.

[20]Nasrallah HA,Tandon R.Efficacy,safety and tolerability of quetiapine in patients with schizophrenia[J].J Clin Psychiatry,2002,63(Suppl 13)：12-20.

[21]Zhang ZG,Bower L,Zhang RL,etal.Three dimensionalmeasurement of cerebralmicrovascular plasma perfusion,glial fibrillary acidic protein andmicrotubule-associated protein2 immunoreactivity after emboli stroke in rats：a double fluorescent labeled laser scanning confocal m icroscopic study[J].Brain Res,1999,844：552-556.

[22]Sammon AM.Maize meal,non-exterified linoleic acid and endem ic cancer of the esophagus-preliminary findings[J].Prostaglandins Other Lipid Mediat,1999,57(2～ 3)：167-171.