山西省北冬蟲夏草優(yōu)良菌株與母種培養(yǎng)基的篩選

程紅艷，郭 偉，常明昌,3，孟俊龍,3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省食用菌工程技術(shù)研究中心，山西太谷030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

北冬蟲夏草又名北蟲草、蛹蟲草，屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）麥角菌（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）的模式種，學(xué)名為Cordyceps militaris[1]。北冬蟲夏草是一種珍貴的藥食同源大型真菌，在分類學(xué)上與冬蟲夏草同歸屬于蟲草屬，藥理作用與冬蟲夏草相似。由于野生蟲草資源極為有限，遠(yuǎn)不能滿足日益增加的市場(chǎng)需求[2]。目前，人工栽培技術(shù)已獲得成功[3-6]。

本研究旨在馴化篩選培育出適合山西省乃至北方地區(qū)栽培的優(yōu)良北冬蟲夏草菌種，為山西省工業(yè)化栽培生產(chǎn)北冬蟲夏草提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)[7]。

1 材料和方法

1.1 北冬蟲夏草優(yōu)良菌株的篩選

1.1.1 供試菌株 1號(hào)菌株C1（吉林桑蠶研究所）；2號(hào)菌株C2（沈陽農(nóng)科院）；3號(hào)菌株C3（山東夏津菌業(yè)）；4號(hào)菌株C4（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種中心）。

1.1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基 （1）斜面培養(yǎng)基：加富PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，瓊脂 2%）。（2）一級(jí)液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨 1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%。（3）罐頭瓶栽培培養(yǎng)基：麥粒35 g+營(yíng)養(yǎng)液50 mL（馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，維生素 B10.01%）。

試驗(yàn)前將引進(jìn)的北冬蟲夏草母種活化，分別轉(zhuǎn)接到加富PDA培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行復(fù)壯和擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.1.3 試驗(yàn)方法

1.1.3.1 拮抗試驗(yàn) 采用加富PDA培養(yǎng)基。將4個(gè)供試菌株交叉配對(duì)接種于同一培養(yǎng)皿上，于25℃培養(yǎng)，觀察菌絲相接觸部分有無拮抗線，以鑒定是否存在重復(fù)菌株。

1.1.3.2 出草試驗(yàn)

1.1.3.2.1 栽培步驟 （1）一級(jí)液體種子的制作：用250 mL的三角瓶裝100 mL一級(jí)種子培養(yǎng)基，于 0.098 MPa（1.0 kg/cm2）的壓力下，溫度 121 ℃，滅菌0.5 h，冷卻后接入復(fù)壯的母種（1支試管菌種接種5瓶），25℃恒溫振蕩暗培養(yǎng)5 d，待用。

（2）裝料與封口：以500 mL罐頭瓶為栽培容器，加入以麥粒為主的培養(yǎng)料和一定量營(yíng)養(yǎng)液，用聚丙烯薄膜覆蓋瓶口，然后用橡皮筋套住封口。

（3）滅菌與接種：將裝料封口的罐頭瓶置于高壓鍋內(nèi)，并在 0.147 MPa（1.5 kg/cm2）的壓力下，溫度129℃，滅菌2 h，冷卻至25℃左右時(shí)，接入一級(jí)液體菌種。接種量一般為每瓶10 mL。

（4）菌絲體培養(yǎng)：將接種后的罐頭瓶置于25℃的環(huán)境中進(jìn)行絕對(duì)避光培養(yǎng)。

（5）誘導(dǎo)子實(shí)體形成：待菌絲體吃透培養(yǎng)基后，移入20～25℃的環(huán)境中進(jìn)行光照培養(yǎng)，要求環(huán)境中光線充足，光線最好是從瓶的頂部射入，每天光照10 h以上，光強(qiáng)500 lx，當(dāng)菌絲變?yōu)殚冱S色時(shí)，在薄膜上扎小孔進(jìn)行通氣，以保持濕度為70%～85%。

（6）采收：待子實(shí)體長(zhǎng)到6～8 cm，其頂部出現(xiàn)許多小刺時(shí)，表明北冬蟲夏草已經(jīng)成熟，即可采收。

1.1.3.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將供試菌株按1.1.3.2.1栽培步驟進(jìn)行瓶栽試驗(yàn)，各菌株設(shè)置重復(fù)20瓶。栽培過程中，觀察和記錄出草時(shí)間、菌絲體長(zhǎng)勢(shì)、子實(shí)體品質(zhì)、產(chǎn)量和生物學(xué)效率。

1.2 北冬蟲夏草母種培養(yǎng)基的篩選

1.2.1 供試菌株 其為1.1中篩選的優(yōu)良菌株。1.2.2 母種培養(yǎng)基 其組成成分如表1所示。

表1 5種母種培養(yǎng)基的組成成分 %

1.2.3 試驗(yàn)方法 將1.1中篩選的最優(yōu)北冬蟲夏草復(fù)壯菌株沿菌落邊緣切下0.5 cm2的菌塊，接種到待篩選的5種母種培養(yǎng)基試管斜面上。每一母種培養(yǎng)基接7管，25℃恒溫培養(yǎng)，定時(shí)觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)（菌絲形態(tài)、色澤、密度），記錄滿管天數(shù)和平均生長(zhǎng)速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 北冬蟲夏草優(yōu)良菌株的篩選

2.1.1 拮抗試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果表明，C1，C2，C3和C44個(gè)供試菌株生長(zhǎng)良好，兩兩間拮抗線明顯，證明沒有重復(fù)，為4個(gè)不同品種。

2.1.2 出草試驗(yàn) 從表2可以看出，4個(gè)品種的菌絲體在麥粒培養(yǎng)料上都可以生長(zhǎng)，但吃透培養(yǎng)料的時(shí)間有所差異，封瓶時(shí)間最早的是C1。經(jīng)新復(fù)極差試驗(yàn)可知，C1的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)高于其他3種，C3沒有進(jìn)行原基分化，C1的平均單瓶子實(shí)體產(chǎn)量最高，生物學(xué)效率為71.5%，明顯高于C2和C4，而且子實(shí)體粗、長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)均一。因此，供試的4個(gè)北冬蟲夏草菌株中，生物學(xué)特性以C1為最優(yōu)，將其用于以后的生產(chǎn)和試驗(yàn)。

表2 北冬蟲夏草4個(gè)菌株間生育特性比較

2.2 北冬蟲夏草母種培養(yǎng)基的篩選

不同培養(yǎng)基北冬蟲夏草中菌絲的生長(zhǎng)速度列于表3。北冬蟲夏草菌絲在5種母種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度不同，菌絲平均生長(zhǎng)速度由快到慢的順序依次是培養(yǎng)基B→A→C→E→D。多重比較表明，菌絲在培養(yǎng)基A中的生長(zhǎng)速度和在培養(yǎng)基B，C，E中的生長(zhǎng)速度差異不顯著，菌絲在培養(yǎng)基B中的生長(zhǎng)速度略高于在培養(yǎng)基A，C，E中的生長(zhǎng)速度，顯著高于在培養(yǎng)基D中的生長(zhǎng)速度。北冬蟲夏草菌絲在培養(yǎng)基B中的生長(zhǎng)速度最快，在培養(yǎng)基D中的生長(zhǎng)速度最慢（表4）。

表3 北冬蟲夏草菌絲在5種母種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度 cm/d

表4 北冬蟲夏草菌絲在5種母種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度的差異

北冬蟲夏草菌絲在選定的5種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀況不盡相同。從菌絲密度、菌落邊緣整齊度、氣生菌絲量、菌絲生長(zhǎng)勢(shì)方面觀察北冬蟲夏草菌絲的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果列于表5。在培養(yǎng)基A和B上，北冬蟲夏草菌絲稠密、粗壯、菌落邊緣整齊、氣生菌絲量適中，但由于北冬蟲夏草菌絲在培養(yǎng)基B中的生長(zhǎng)速度最快，因此我們將B培養(yǎng)基選定為最優(yōu)母種培養(yǎng)基，配方是：馬鈴薯20%，蔗糖2%，蛋白胨2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，瓊脂2%。

表5 不同培養(yǎng)基配方對(duì)北冬蟲夏草菌絲生長(zhǎng)狀況的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

（1）在4個(gè)供試菌株中，拮抗試驗(yàn)和出草試驗(yàn)結(jié)果表明，由吉林桑蠶研究所引進(jìn)的C1菌株在生長(zhǎng)勢(shì)、子實(shí)體品質(zhì)、子實(shí)體產(chǎn)量和生物學(xué)效率方面明顯優(yōu)于其他3個(gè)菌株，適合在山西省進(jìn)行栽培和推廣。

（2）在供試的5個(gè)母種培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，篩選出的最適母種培養(yǎng)基配方為馬鈴薯20%，蔗糖2%，蛋白胨2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，瓊脂2%。

3.2 討論

由于我國(guó)推廣北冬蟲夏草栽培的時(shí)間較短，菌種多數(shù)從野生菌體中分離純化而得，很少進(jìn)行孢子選育等穩(wěn)定性育種工作。本試驗(yàn)的菌株也存在這種情況，菌株間表現(xiàn)差異大，種性容易出現(xiàn)變異和退化，所以北冬蟲夏草育種工作亟待加強(qiáng)。另一方面，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，北冬蟲夏草商業(yè)化栽培時(shí)常出現(xiàn)同一品種菌株在不同季節(jié)、不同批次表現(xiàn)出很大差異，甚至同一批次還會(huì)出現(xiàn)部分培養(yǎng)基不產(chǎn)子座的現(xiàn)象。其中，菌種退化、壽命短、難保存是其最突出的問題，它們直接制約著北冬蟲夏草的栽培和生產(chǎn)。因?yàn)楸倍x夏草對(duì)生長(zhǎng)基質(zhì)及生態(tài)環(huán)境與一般食用菌不同，而且長(zhǎng)期采用無性繁殖及多次轉(zhuǎn)管的北冬蟲夏草菌種，其母種培養(yǎng)基因容易變異，表現(xiàn)為出草畸形甚至不出草，產(chǎn)量和質(zhì)量都不穩(wěn)定，生物轉(zhuǎn)化率較低[8]。

目前，對(duì)北冬蟲夏草的研究熱點(diǎn)仍主要集中在人工栽培技術(shù)和無性繁殖世代的研究上，探索北冬蟲夏草在人工培養(yǎng)基上失活的遺傳背景和分子遺傳變異基質(zhì)及有效的保存方法，不僅具有理論價(jià)值，亦具有實(shí)際價(jià)值[9]。所以，菌株的季節(jié)性試驗(yàn)、生長(zhǎng)條件試驗(yàn)和育種試驗(yàn)具有同等重要的意義。任何一個(gè)優(yōu)良菌種，只有在適宜的生長(zhǎng)條件下，生理代謝活動(dòng)才能正常進(jìn)行，優(yōu)良性狀才能得以表現(xiàn)。環(huán)境條件中最基本的是培養(yǎng)基質(zhì)[10]。因此，對(duì)引進(jìn)的菌種必須先進(jìn)行母種培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)（以保證母種的質(zhì)量），在母種培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)中，菌絲生長(zhǎng)發(fā)育好壞是鑒定環(huán)境是否合適的一個(gè)重要指標(biāo)。

［1］ 劉波.中國(guó)藥用真菌[M].太原：山西人民出版社，1984.

［2］ 常明昌.食用菌栽培 [M].2版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009.

［3］王國(guó)棟.冬蟲夏草類——生態(tài)培植應(yīng)用[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1995．

［4］ 苑貴華.吉林蛹蟲草及馴化栽培[J].食用菌，1988（3）：8.

［5］ 李玉春.蛹蟲草人工培育技術(shù)的研究[J].中南林學(xué)院學(xué)報(bào)，1989，9（2）：212-217.

［6］ 陳國(guó)卿.遼寧蟲草研究[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，1989（1）：4-6.

［7］ 田良才，牛天堂，李晉川.關(guān)于山西現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的戰(zhàn)略思考[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（9）：38-44.

［8］ 梁宗琦.蛹蟲草的無性型及子實(shí)體的人工培養(yǎng)研究 [J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1990，3（2）：1-6.

［9］ 韓秀麗，方亮，周晶，等.虎榛子外生菌根合成與篩選的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2005，20（2）：101-104.

［10］ 渠繼紅，羅雯娟，韓曉芳，等.真姬菇原種及袋栽培養(yǎng)基配方的篩選[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：18-20.