甘草黃酮提取及其抗氧化能力測定方法研究進(jìn)展

韓雅慧，陶寧萍

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

甘草又名甜草、蜜草、美草等，其藥用部位為豆科（Leguminosae）植物甘草屬（Glycyrrhiza）甘草（Licorice）的根及根狀莖[1]。據(jù)《中華人民共和國藥典》2000年版記載，甘草有3個(gè)品種，即烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensi Fisch）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）和光果甘草（Glycyrrhiza glabra L）[2]。甘草有效成分包括黃酮類、三萜類、多糖等。迄今為止，已從甘草中分離出150多個(gè)黃酮類化合物，主要包括黃酮類、黃酮醇類、查爾酮類、雙氫黃酮類、雙氫查爾酮類等[3]。甘草黃酮具有明顯的抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、保肝等藥理作用，尤其在發(fā)現(xiàn)它具有抗艾滋病病毒[4]作用后，甘草黃酮類化合物的研究引起了人們的廣泛關(guān)注和重視。

本文綜述了甘草黃酮的提取方法及其抗氧化能力測定方法的研究現(xiàn)狀，以期為甘草黃酮類成分的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 甘草黃酮的提取方法及比較

1.1 甘草黃酮的提取方法

甘草黃酮的提取方法很多，基本原理都是通過物理、化學(xué)方法破壞甘草的細(xì)胞壁，再根據(jù)甘草黃酮的極性及溶解性能的差異進(jìn)行提取分離。1.1.1 溶劑萃取法 它包括無機(jī)溶劑萃取法和有機(jī)溶劑萃取法。其主要原理是利用甘草黃酮能溶于堿水或甲醇等有機(jī)溶劑的特性來提取甘草黃酮。其中，有機(jī)溶劑萃取法是目前國內(nèi)外提取甘草中黃酮類物質(zhì)最為廣泛的方法，可用冷浸法或加熱抽提法提取，乙醇和甲醇是普遍采用的浸提液。但建明等[5]以NaOH水溶液為浸提液，正交設(shè)計(jì)提取甘草渣中黃酮類化合物得出，最佳提取工藝為0.2 mol/LNaOH，料液比為1∶14，提取溫度90℃，提取時(shí)間0.5 h。劉曉風(fēng)等[6]利用乙醇回流法提取市售甘草黃酮，正交試驗(yàn)得到最佳提取工藝為料液比1∶20，提取溫度85℃，提取時(shí)間3 h，乙醇濃度75%，提取率達(dá)到2.49%。楊慧等[7]選擇NaOH和乙醇的混合溶液作為浸提液，利用回流法提取內(nèi)蒙古產(chǎn)甘草渣中黃酮，試驗(yàn)獲得的最佳工藝條件為堿醇（NaOH濃度0.4 mol/L，乙醇濃度75%）比為1∶2，料液比1∶30，回流時(shí)間3 h，回流溫度95℃，提取率達(dá)到4.21%。田慶來等[8]以三烷基氧化膦（Trialkylphosphine Oxide，TRPO）石油醚溶液為浸提液，對(duì)市售甘草片進(jìn)行黃酮提取，正交試驗(yàn)表明，TRPO濃度影響總黃酮提取率程度大于有機(jī)相與水相的體積比（A/O），總黃酮提取率隨A/O的增大而減小，隨浸提液濃度的增大迅速提高，通過此法可實(shí)現(xiàn)水溶性甘草黃酮和甘草酸的分離。

1.1.2 超聲輔助溶劑提取法 其原理是利用超聲波使植物組織在溶劑中瞬時(shí)產(chǎn)生空化泡崩潰，進(jìn)而細(xì)胞破裂，溶劑與植物細(xì)胞內(nèi)部成分相互滲透，增加了黃酮在溶劑中的溶解。曾超珍等[9]利用此法通過正交試驗(yàn)提取市售甘草中的黃酮得出，在超聲功率385 W，80%乙醇，料液比1∶15，提取時(shí)間8 min的提取條件下，黃酮提取率達(dá)到6.23%。劉紅等[10]研究了超聲時(shí)間對(duì)人工栽培2年生烏拉爾甘草中黃酮提取率的影響，結(jié)果表明，在室溫下超聲提取80 min較合適。另外，王應(yīng)強(qiáng)[11]、何璐[12]、李炳奇[13]等分別對(duì)不同甘草品種進(jìn)行超聲輔助提取的工藝研究，表明超聲技術(shù)已廣泛應(yīng)用于甘草黃酮的提取。

1.1.3 微波輔助溶劑提取法 微波可直接作用于分子，使其熱運(yùn)動(dòng)加劇，溫度升高，這種熱效應(yīng)使微波穿透到介質(zhì)內(nèi)部，加速細(xì)胞壁的破壞，使甘草黃酮類物質(zhì)更快地被分離提取出來。孫萍等[14]首次使用微波法從甘草中提取黃酮，測得黃酮提取率為1.721%。張明華等[15]采用微波輔助乙醇提取法對(duì)烏拉爾甘草進(jìn)行黃酮提取的條件優(yōu)化，單因素試驗(yàn)結(jié)果確定最佳工藝條件為：料液比為1∶18，預(yù)浸泡時(shí)間1 h，微波功率420 W，乙醇濃度70%，微波時(shí)間50 s，微波次數(shù)1次，黃酮提取率為4.080 7%。史高峰等[16]設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，采用微波輔助法對(duì)甘草渣（寧夏產(chǎn)，1年生）中總黃酮提取方法進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，在80%乙醇，料液比1∶10，微波功率300 W，微波輔助回流60 min的條件下，黃酮提取率為0.408%。張夢(mèng)軍等[17]采用均勻設(shè)計(jì)來優(yōu)化微波提取市售甘草中黃酮的試驗(yàn)條件，并且將微波法與水浸提法進(jìn)行了比較，微波法優(yōu)化結(jié)果為：料液比1∶8，乙醇濃度38%，微波功率288 W，加熱時(shí)間1 min，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微波法的提取效率明顯優(yōu)于水浸提法。

1.1.4 超臨界流體萃取法（SFE） 在超臨界狀態(tài)下，超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小不同的成分依次萃取出來，并且通過控制CO2的壓力和溫度來控制溶解度和蒸汽壓這2個(gè)參數(shù)來進(jìn)行分離。超臨界萃取通過使植物細(xì)胞壁高度破碎，增加黃酮類物質(zhì)與溶劑的接觸面積和萃取通道，同時(shí)還使黃酮與纖維素結(jié)合力降低，從而提高萃取率。付玉杰等[18]以萃取溫度、萃取壓力、夾帶劑用量、CO2流量、分離壓力和分離溫度為指標(biāo)，確定超臨界CO2萃取烏拉爾甘草中黃酮的最佳工藝條件，并以此最佳工藝與乙醇提取法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，超臨界CO2萃取法的甘草黃酮提取率比溶劑提取法高2.2倍。付玉杰等[19]還采用單因素試驗(yàn)對(duì)甘草地上部分（莖葉）的超臨界CO2提取工藝進(jìn)行了研究，以總黃酮提取率和含量為指標(biāo)，總黃酮提取率達(dá)到2.09%，黃酮含量為5.42%，為工業(yè)化SFE-CO2法生產(chǎn)粗甘草黃酮提供了有價(jià)值的工藝參數(shù)。

1.1.5 復(fù)合酶法 它是在傳統(tǒng)的溶劑提取方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)植物藥材細(xì)胞壁的構(gòu)成，利用酶反應(yīng)所具有的高度專一性等特點(diǎn)，選擇相應(yīng)的酶，將細(xì)胞壁水解或降解，使有效成分充分暴露出來，溶解、混懸于溶劑中，從而達(dá)到提取細(xì)胞內(nèi)有效成分的目的。張志東等[20]利用復(fù)合酶法結(jié)合醇提法提取甘草廢渣中的黃酮，確定了復(fù)合酶處理的條件，即：纖維素酶添加量833.5 nkat/mL，果膠酶1 667 nkat/mL，反應(yīng)pH 6.0，溫度55℃，作用120 min，最終提取率達(dá)到2.25%，該法較利用醇提法提取甘草渣中黃酮得率提高了25%以上。王蕓蕓等[21]采用纖維素酶和果膠酶從甘草渣中提取甘草總黃酮，并與醇提法相比較，結(jié)果得出，復(fù)合酶法提取的游離總黃酮含量提高了1.15倍。

1.1.6 閃式提取法 其主要原理是在適當(dāng)溶劑存在條件下，利用高速機(jī)械剪切力和攪拌力，迅速破壞植物細(xì)胞組織，使細(xì)胞組織內(nèi)部的有效成分與溶劑充分接觸，快速溶解轉(zhuǎn)移，在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到內(nèi)外溶解平衡。鄧引梅等[22]對(duì)比研究了閃式提取、索氏抽提、攪拌提取、超聲波提取對(duì)脹果甘草葉總黃酮的提取效果，并利用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，用閃式提取法提取時(shí)間短，提取溶劑用量少，最佳提取工藝為：料液比1∶40，乙醇濃度70%，提取時(shí)間6 min，黃酮提取率為2.917%。此后，鄧引梅等[23]又在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上探索了響應(yīng)面法確定閃式提取甘草葉中總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)的可行性，最佳工藝條件為：料液比1∶40.3，乙醇濃度70.2%，提取時(shí)間5 min，在此工藝條件下，總黃酮的提取率達(dá)到2.91%，與模型預(yù)測值基本相符。

1.1.7 半仿生提取法（Semi-bionic Extraction method，SBE法） 其原理是從生物藥劑學(xué)的角度，模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的原理，為經(jīng)消化道給藥的中藥制劑創(chuàng)立一種新的提取工藝。孫秀梅等[24]對(duì)甘草飲片顆粒化研究，SBE提取工藝將水浸提提取工藝中pH 7.0的水分別改用pH 2.0的水作第1煎，pH 6.5的水作第2煎，pH 9.0的水作第3煎，制得SBE液，并以甘草次酸、甘草總黃酮、浸膏量為指標(biāo)，將2種方法進(jìn)行比較，研究表明，SBE法優(yōu)于水浸提法。徐萍[25]將方藥分成混煎組和桂枝、甘草單煎混合組，用半仿生提取法提取，提取液作甘草次酸、肉桂酸、總黃酮、揮發(fā)油、干浸膏的含量測定及50%乙醇精制液的HPLC指紋圖譜比較，結(jié)果表明，除干浸膏含量單煎混合液與混煎液相近外，其余4個(gè)指標(biāo)成分的含量，混煎液均明顯高于單煎混合液。

1.2 7種提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較[26]

上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)（表1），在提取甘草黃酮時(shí)，多采用2種或2種以上的方法輔助提取，如超聲-微波協(xié)同萃取法[27]、復(fù)合酶法及微波法[28]等。汪河濱等[29]比較了溶劑提取法、超聲波、微波、超聲-微波協(xié)同萃取4種不同提取方法提取甘草黃酮的效果，結(jié)果表明，超聲-微波協(xié)同萃取法提取甘草黃酮效果最好。

表1 7種提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

2 甘草黃酮的抗氧化能力測定方法[30-31]

國內(nèi)外對(duì)抗氧化劑的研究十分重視，近幾年，美國、日本及歐洲國家均將其作為功能食品素材的研究重點(diǎn)，并已建立了多種測定甘草黃酮抗氧化活性的方法?，F(xiàn)將常用的方法分述如下。

2.1 國標(biāo)法

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.37—1996中食用油過氧化值（POV）的檢驗(yàn)方法進(jìn)行測定。崔永明等[32]使用此法測定了甘草總黃酮對(duì)4種油脂的抗氧化作用，結(jié)果顯示，甘草黃酮可以作為油脂的抗氧化劑，并且其對(duì)豬油的抗氧化效果更好。朱少華等[33]對(duì)甘草查爾酮抗脂質(zhì)過氧化及清除自由基的能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮具有明顯的抗脂質(zhì)過氧化作用，其作用機(jī)制可能是對(duì)羥基自由基（·OH）的直接清除作用所致。

2.2 FRAP法[34]

FRAP（鐵離子還原能力，ferric ion reducing antioxidant power）法又稱氧化還原法，其原理是甘草黃酮中的抗氧化物質(zhì)將Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+與Fenton類物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，反應(yīng)的結(jié)果以Fe2+的當(dāng)量或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的抗氧化能力表示。該法具有快速簡便，易于操作，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。李銘花等[35]研究甘草4種不同極性溶劑提取物中黃酮和總酚含量，并采用FRAP法測定各提取物的抗氧化能力，結(jié)果顯示，極性較大的有機(jī)溶劑的對(duì)應(yīng)提取物還原能力較強(qiáng)，且甘草總酚、黃酮含量與其抗氧化活性間存在較好線性關(guān)系。吳碧華等[36]研究了甘草黃酮對(duì)Fenton反應(yīng)生成的·OH具有較強(qiáng)的直接清除作用，其清除·OH的IC50（自由基被抑制1/2時(shí)抑制劑的濃度）是甘露醇的1/255，其抑制·OH生成的IC50是甘露醇的1/139，提示了甘草總黃酮有可能作為一種新的天然抗氧化劑。此后，吳碧華等[37]又研究了甘草黃酮對(duì)超氧陰離子（O2-）和·OH的清除和抑制作用，結(jié)果表明，甘草黃酮不僅對(duì)·OH具有清除作用，且清除率與藥物濃度呈正相關(guān)，而且對(duì)·OH的生成速度也具有明顯的抑制作用，療效明顯優(yōu)于維生素E和甘露醇。

2.3 DPPH法[38]

DPPH（1，1-二苯基苦基苯肼）是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，抗氧化物質(zhì)可以使其還原、顏色變淺，根據(jù)吸光度的變化可測得抗氧化劑的活性。趙麗娜等[39]對(duì)新疆產(chǎn)3種甘草渣中甘草黃酮含量及其抗氧化活性進(jìn)行了比較研究，結(jié)果顯示，3種甘草渣中總黃酮含量以烏拉爾甘草渣最高，其DPPH清除率達(dá)到4.08%。羅峰等[40]研究了光果甘草、烏拉爾甘草、脹果甘草3種甘草品種的總黃酮提取方法，DPPH法測定其抗氧化活性，并分析了甘草品種、應(yīng)用微波處理、甘草放置時(shí)間、提取溫度對(duì)甘草抗氧化活性的影響，結(jié)果顯示，除提取溫度外，其他3個(gè)因素對(duì)甘草抗氧化活性有較大影響。

2.4 鄰苯三酚自氧化法[41]

在堿性條件下，鄰苯三酚能迅速自氧化，釋放出O2-·，生成帶色的中間產(chǎn)物，且鄰苯三酚自氧化速率與生成O2-·的濃度呈正相關(guān)，中間產(chǎn)物在420 nm波長有強(qiáng)烈光吸收?？寡趸瘎┠艽呋疧2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，故可通過紫外可見光分光光度法來定量測定抗氧化劑在此體系中對(duì)O2-·的清除作用，間接評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化能力。索金玲等[42]采用此法評(píng)價(jià)了石榴葉總黃酮提取物的體外抗氧化能力，結(jié)果表明，石榴葉總黃酮抑制鄰苯三酚自氧化能力高于維生素C。楊玲等[43]利用超聲-微波系統(tǒng)萃取烏拉爾甘草中多糖類物質(zhì)，并利用DPPH法、FARP法及鄰苯三酚自氧化法分別測定甘草多糖對(duì)DPPH·，·OH和O2-·的清除能力，結(jié)果表明，在同等濃度下，甘草多糖對(duì)DPPH·清除能力強(qiáng)于維生素E但低于維生素C，清除·OH能力比O2-·強(qiáng)。

2.5 熒光分光光度法[44]

熒光法主要檢測對(duì)羥基的抗氧化能力（Hydroxyl Radical Antioxidant Capacity，HORAC），其原理是過氧化氫自由基對(duì)熒光探針具有氧化作用，并使得探針的熒光減弱，當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，探針的熒光減弱被抑制。根據(jù)這一特性，可測定樣品對(duì)氧自由基清除活性，測定結(jié)果以TroloxTM（標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑）當(dāng)量表示，具體在衰變曲線中，常使用AUC（曲線下面積）作為最終指標(biāo)。WANG[45]主要研究了L-苯氨酸-Fe2+-H2O2體系產(chǎn)生羥基自由基的最佳條件，并測試了赤芍、鉤藤、姜黃、炒蒺藜4種黃酮類中草藥水提物的抗氧化活性，建立了一種測定中草藥抗氧化活性的方法。李滿秀等[46]研究了山楂、槐米、沙棘莖皮3種樣品提取物對(duì)O2-·的清除作用，結(jié)果顯示，3種樣品對(duì)O2-·的清除能力與提取物濃度均有明顯的量效關(guān)系，且它們清除O2-·的能力依次為：槐米＞沙棘＞山楂。

3 前景與展望

目前，市場上已經(jīng)有很多的黃酮產(chǎn)品，比如黃酮片、六味黃酮茶以及各種黃酮類藥品。甘草黃酮雖然具有明顯的抗氧化作用，可以預(yù)防腫瘤的發(fā)生，對(duì)胃潰瘍、肝損害、病原微生物、酶及抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)等方面都有明顯的藥理作用，但甘草黃酮類的產(chǎn)品卻很少，所以使用先進(jìn)的分析分離技術(shù)，特別是對(duì)甘草黃酮類化合物中單一成分分離純化，可為新藥、新產(chǎn)品資源的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

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