滇南小耳豬精液的直接冷凍保存

鄭 紅，李 波，楊世華，陳麗玲，何保麗，角建林

(1.昆明醫(yī)學(xué)院，昆明 650031;2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650224)

滇南小耳豬精液的直接冷凍保存

鄭 紅1，李 波1，楊世華2，陳麗玲1，何保麗1，角建林1

(1.昆明醫(yī)學(xué)院，昆明 650031;2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650224)

目的 建立滇南小耳豬精液冷凍保存方法，加速云南省特有小型豬種的小型化選育。方法 利用脈沖電刺激模式誘導(dǎo)公豬輸精管自助收縮排精。利用直接冷凍新技術(shù)(DFM)研究不同冷凍方案對精子的運(yùn)動度、精子頂體完整性和體內(nèi)授精胚胎發(fā)育能力的影響。結(jié)果 在直接冷凍方法中，3%甘油防凍劑的作用下，60 s植冰時間和1.5mm/s的冷凍降溫參數(shù)對精子運(yùn)動度保護(hù)良好，精子運(yùn)動復(fù)蘇率達(dá)到61.7%。但是，3%乙二醇雖然與甘油一樣對精子的頂體完整性都有很好的保護(hù)作用，對精子運(yùn)動度保護(hù)能力較差。此外，3%甘油、60 s植冰、1.5mm/s冷凍速度的直接冷凍的凍精解凍，移植到超數(shù)排卵的母豬子宮頸口實(shí)施人工授精，獲得卵的受精和胚胎發(fā)育潛能尚可。結(jié)論 玻璃管直接冷凍可以完成滇南小耳豬精子的冷凍保存。

滇南小耳豬;電刺激采精;精液冷凍保存;直接冷凍法;人工授精

豬精液冷凍保存與應(yīng)用研究始于20世紀(jì)70年代［1］，國內(nèi)的研究始于20世紀(jì)80年代［2］，但至今豬冷凍精液的生產(chǎn)與應(yīng)用仍沒有其它家畜普及。其主要原因是豬精子對低溫特別敏感，在冷凍解凍過程中極易受到損傷，所以豬冷凍精液的生產(chǎn)、應(yīng)用難度大，操作程序較復(fù)雜。然而豬精液冷凍對提高優(yōu)秀種公畜的利用率，開展瀕臨絕種的優(yōu)良品種的保種、育種工作等都有重要意義。

近年來，由以色列科學(xué)家發(fā)明的直接冷凍法(directional freezing Method，DFM)受到諸多關(guān)注，利用此項技術(shù)已經(jīng)完成了大容量冷凍多種野生動物的精子，并成功實(shí)施了人工授精試驗(yàn)［3－7］。本研究以滇南小耳豬的電刺激采集的精液為對象，采用直接冷凍法探討豬精子冷凍機(jī)理和方法，為將來成功實(shí)施商品化凍精生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心自繁封閉群云南滇南小耳豬，公豬3頭，15～24月齡，體重在25～48 kg;初情期母豬1頭，7月齡，體重32 kg。臨床檢測未見生殖器官的器質(zhì)性變化。所有實(shí)驗(yàn)動物在實(shí)驗(yàn)期間采用單籠飼養(yǎng)，配方飼料喂養(yǎng)，適當(dāng)補(bǔ)充青飼料［SYXK(滇)2005－0004］。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

美國 Lane Pulsator IV型(Lane mfg.inc.Denver.Co.)電刺激采精儀和直徑為30mm的直腸探頭。激光共聚焦顯微鏡(Confocal Microscopy，Carl Zeiss 510META)。以色列 MTG516冷凍 儀;MTG516冷凍儀專用的中空玻璃管(2mL)及膠塞。超數(shù)排卵激素PMSG和HCG來自寧波激素二廠，其他試劑購于美國SIGMA公司。

凍精稀釋液配方:葡萄糖 3.715 g;檸檬酸三鈉0.60 g;EDTA鈉鹽0.125 g;碳酸氫鈉0.125 g;氯化鉀 0.075 g;青霉素鈉0.06 g;硫酸鏈霉素 0.1 g;重蒸水定溶至100mL。pH值調(diào)整為7.2，再用0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃保存，一周內(nèi)使用。使用時37℃預(yù)平衡。

防凍液配方:稀釋液∶卵黃∶甘油/乙二醇:OEP=76.5∶20∶3∶0.5(體積比)，使用時 5℃預(yù)平衡。防凍液儲存時間不超過兩周。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 精液采集和檢驗(yàn):采用Lane Pulsator IV型電刺激采精儀通過直腸電刺激采精法獲得精液［8］。采集的精液經(jīng)4～5層滅菌紗布過濾除去膠體雜質(zhì)后，立即檢測精子質(zhì)量，選取密度大于3.0×108個/mL、運(yùn)動度大于 65%的樣本為試驗(yàn)材料(2頭公豬)，37℃水浴30 min送抵實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 精液稀釋和平衡程序:精液在室溫(22℃)下靜置5～10 min后，1200 r/min離心10 min，棄上清液，用配置好的稀釋液按33.3∶66.7的比例進(jìn)行稀釋，將稀釋后的精液放于4℃的冰箱內(nèi)，平衡1 h。檢查精子活力，取精子運(yùn)動度在65%以上的精液進(jìn)行冷凍。

1.3.3 精液直接冷凍法:使用MTG516冷凍儀和專用的中空玻璃管(2mL)及膠塞，將含有冷凍保護(hù)劑并平衡1 h的精液(20%(V/V)卵黃、3%(V/V)甘油/乙二醇、0.5%(V/V)OEP)裝入4℃預(yù)冷的中空玻璃管內(nèi)，放置于 MTG516的 A艙內(nèi)，設(shè)置主控表參數(shù)，使通道推進(jìn)桿按照所設(shè)計的速率(Va)推動冷凍中空管通過A艙進(jìn)入B艙，停留60 s完成植冰(seeding)過程，再以一定的速率(Vb)推動冷凍管通過B艙，并進(jìn)入C艙。最后將C艙中已經(jīng)完成冰晶生長的中空冷凍管投入液氮中保存。A艙的溫度為4℃，B艙 －70℃，C艙為－150℃。本實(shí)驗(yàn)主要通過設(shè)計不同的 Vb(0.5mm/s、1.0mm/s、1.5mm/s、2.0mm/s、2.5mm/s)進(jìn)行冷凍試驗(yàn)。

1.3.4 精液解凍方法:將冷凍管從液氮中取出，置于空氣中60 s后，放入具有38℃溫水的解凍儀銅管中，停留90 s后，取出，倒出精液，并在室溫下1200 r/min離心10 min，去掉上清液，加入稀釋液進(jìn)行稀釋，放置于 38℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 10～30 min，檢測冷凍精子質(zhì)量。

1.3.5 冷凍復(fù)蘇精子功能的檢測

1.3.5.1 精子的運(yùn)動度:精子的運(yùn)動度為運(yùn)動精子的百分率，冷凍前和解凍復(fù)蘇后分別記數(shù)精子的運(yùn)動度。取10 μL精子滴加到預(yù)熱37℃的干凈玻片上，在顯微鏡下記數(shù)活動精子的百分率。每次計數(shù)200個精子，并至少重復(fù)一次。計算精子運(yùn)動度復(fù)蘇率:精子運(yùn)動度復(fù)蘇率% =(復(fù)蘇精子運(yùn)動度%×100)/冷凍前精子的運(yùn)動度%。

1.3.5.2 頂體的完整率檢測:用熒光染料 FITCPNA(Invitrogen公司)標(biāo)記頂體完整的精子，染色步驟參照Esteves等［9］的方法進(jìn)行。新鮮或冷凍復(fù)蘇精子用DPBS洗滌后離心，棄上清液，均勻涂在干凈的玻璃片上，室溫干燥，再用無水甲醇4℃固定30 s，置于空氣中風(fēng)干待測。染色時，加入用DPBS溶液配制的FITC－PNA，使染料濃度為40 mg/mL，避光孵育20 min，洗去多余染料后，加入抗淬滅劑，封片。在激光共聚焦顯微鏡(Confocal Microscopy，Carl Zeiss 510 META)下檢查，激發(fā)光波長490 nm，發(fā)射光波長515 nm。頂體完整的精子頭部被染成均勻的蘋果綠色，而頂體破裂精子頭部僅部分著色或不被染色。記數(shù)頂體完整精子占精子總數(shù)的百分率，每次至少計數(shù)200個精子。

1.3.6 解凍后精液人工授精和回收的原核期胚胎的體外發(fā)育試驗(yàn):將中空玻璃管的凍精(1管，2mL)解凍，并稀釋至10mL。將稀釋精液通過精子移植導(dǎo)管注入到1頭經(jīng)過超排處理的母豬子宮頸口，完成授精過程。在hCG處理50 h后，采用常規(guī)方法，暴露輸卵管。用吸滿預(yù)溫(37℃)TL－Hepes沖卵液的20mL注射器從輸卵管子宮端向傘部方向刺入輸卵管沖胚，用15mL離心管收集沖卵液，38℃保存送實(shí)驗(yàn)室。在體視顯微鏡下?lián)炻?，用TL－Hepes液洗滌3次，在50 μL的PZM4胚胎培養(yǎng)滴中洗滌3次并培養(yǎng)［10］，培養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為 38.5℃，5%CO2、5%O2、90%N2空氣的飽和濕度的培養(yǎng)箱。每天觀察和統(tǒng)計胚胎發(fā)育情況，間隔1 d換相同量新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第 7 天為止［11］。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 進(jìn)樣速率對豬精子的冷凍保護(hù)的影響

調(diào)節(jié)植冰時間為60 s時，研究不同進(jìn)樣速率對冷凍精子的影響。重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在甘油組中，進(jìn)樣速率(0.5mm/s～2.5mm/s)對精子的冷凍復(fù)蘇的運(yùn)動度有一定影響，速率為1.5mm/s的冷凍精子的運(yùn)動度較其它組高(P＜0.05)，為49.6%，運(yùn)動度復(fù)蘇率也達(dá)到61.7%(表1)。而乙二醇組中，各冷凍組的精子運(yùn)動度及運(yùn)動度復(fù)蘇率均很低。對頂體完整性研究發(fā)現(xiàn)，所有實(shí)驗(yàn)組的頂體完整率均超過90%，與對照組(鮮精)相比差異不顯著(P＞0.05)(圖1)。

2.2 解凍精子的受精能力的檢測

本研究將中空玻璃管的凍精(1管，2mL)解凍，并稀釋至10mL，移植到1頭經(jīng)過超排處理的母豬陰道與子宮的結(jié)合部位，待完成體內(nèi)受精的時間后，從輸卵管中沖出已排出的卵子，監(jiān)測卵子的受精比率和原核期胚胎的發(fā)育能力。結(jié)果顯示(表2)，解凍的精子均獲得了較高比例受精卵和發(fā)育到囊胚。

表1 不同進(jìn)樣速率(Vb)對精子運(yùn)動度的影響Tab.1 The effects of different speed levels pushing the sample into the freezing box on the ice seeding

表2 解凍精子人工授精和原核期胚胎的發(fā)育能力Tab.2 The developmental potential of pronuclear embryos fertilized by the－frozen－postthaw sperms in vivo

圖1 不同冷凍進(jìn)樣速度和冷凍保護(hù)劑對冷凍精子頂體完整率的影響Fig.1 The acrosomal intergrit of postthawed sperms in DFM with 60 s seeding ice and 3%glycerol and EG

3 討論

Cordova［11］報道與 0.5mL 麥管中冷凍相比，在5mL麥管中冷凍對穿透、單精受精、多精受精、活力和正常頂體完整性沒有任何有害的影響。此后他又報道冷凍于5mL麥管中的精子比冷凍于0.5mL麥管精子的染色質(zhì)明顯的穩(wěn)定［12］。Saravia等［13］發(fā)現(xiàn)單個扁平袋子和多重扁平袋子(各自為54%和49%)中冷凍的精子比0.5mL塑料細(xì)管(38%)中冷凍的精子質(zhì)膜完整率高，解凍后多重扁平袋子比0.5mL塑料細(xì)管每劑量中存在更多活精子。所以，提出大型細(xì)管和扁平袋子在生產(chǎn)實(shí)踐上更有廣泛應(yīng)用的潛力。直接冷凍的儀器和方法是以色列科學(xué)家專門為大容量冷凍精液而設(shè)計的精子冷凍儀，可以冷凍2mL、5mL、8mL容量的精液，已經(jīng)成功運(yùn)用在野生動物，如大象［3］，犀牛［4］，馬［5］，兔［6］等，以及二次重復(fù)冷凍牛的精子［7］。在本研究中，雖然選用這些動物的冷凍參數(shù)，但是冷凍效果很差。經(jīng)過試驗(yàn)，調(diào)節(jié)植冰(seeding)的時間和樣品冷凍進(jìn)樣速率可以大大增加了保護(hù)能力，這說明豬精子特殊性，已經(jīng)對較長時間的植冰和冷凍的低耐受性。另外，從精子的頂體的完整性考慮，本方法十分有效，這與其他報道相似［10－13］。是否還有更多的提升空間，尚需要繼續(xù)調(diào)節(jié)各個參數(shù)，優(yōu)化方案。

精子的熒光染色技術(shù)是近年來興起的染色技術(shù)，牛和豬精子頂體熒光染色結(jié)果與直線運(yùn)動精子數(shù)、低滲腫脹試驗(yàn)(HOST)等方法的結(jié)果高度相關(guān)，而且用電鏡技術(shù)也證實(shí)了染色檢測的可靠性［14］。本研究選用絡(luò)合異硫氰酸熒光素(FITC)植物凝集素－花生凝集素(PNA)。FITC具有熒光性，而與之相連的PNA可與頂體膜外的復(fù)合糖類相作用，頂體完整精子頂體部發(fā)強(qiáng)光，且邊緣光滑;頂體部分發(fā)熒光或無熒光，為頂體破損或完全破壞精子［15］。PNA與頂體膜外的復(fù)合糖的結(jié)合是特異性的，從而準(zhǔn)確預(yù)測精子的受精能力［16－17］。

目前認(rèn)為，最準(zhǔn)確監(jiān)測凍精的受精能力的方法是人工授精和體外受精，因?yàn)檫@也是凍精的主要目的。但人工授精的測試的試驗(yàn)時間長，當(dāng)由凍精實(shí)施人工授精所產(chǎn)生的新生動物出生方可得到說明，這一過程受到諸多因素的干擾影響，很難及時反映凍精的能力。而本研究中，選用超數(shù)排卵結(jié)合人工授精，監(jiān)測卵子的受精和發(fā)育潛能，就可以可以在很短時間內(nèi)得出可、比較可靠的結(jié)論。這種方法有望在將來凍精的監(jiān)測中得到廣泛使用。本研究中，由于時間等關(guān)系，盡管實(shí)施人工授精和胚胎發(fā)育能力測試沒有重復(fù)試驗(yàn)，凍精的受精胚胎的囊胚率可達(dá)到80%左右，這與對照沒有差異，也與已報道豬的相應(yīng)結(jié)果沒有差異［18］

4 結(jié)論

本研究首次完成了滇南小耳豬精子的直接冷凍法冷凍，通過精子的運(yùn)動度、頂體的完整性和人工授精及早期胚胎培養(yǎng)的三者結(jié)合檢測冷凍精液的效果。60 s植冰時間時，3%甘油對精子運(yùn)動度保護(hù)良好，其中1.5mm/s的冷凍降溫參數(shù)的運(yùn)動復(fù)蘇率達(dá)到61.7%，但3%乙二醇對精子運(yùn)動度保護(hù)能力較差，雖然它與甘油一樣對精子的頂體完整性都有很好的保護(hù)作用。此外，60 s植冰、3%甘油、1.5mm/s冷凍速度的直接冷凍的凍精解凍，移植到超數(shù)排卵的母豬子宮頸口實(shí)施人工授精，獲得卵的受精和胚胎發(fā)育潛能尚可。本研究說明，玻璃管直接冷凍可以完成滇南小耳豬精子的冷凍保存，為將來體外受精研究和實(shí)現(xiàn)凍精用于生產(chǎn)實(shí)踐奠定了一定基礎(chǔ)。

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Cryopreservation of Sperms with Directional Freezing Method in Yunnan Diannan Miniature Pig

ZHENG Hong1，LI Bo1，YANG Shi－h(huán)ua2，Chen LI－ling1，HE Bao－li1，JIAO Jian－lin1
(1.Laboratory Animal Center，KunMing Medical College，KunMing 650031，China;2.Bio－technique College，KunMing Engineering University，KunMing 650224，China)

Objective To establish the cryopreservation of sperm genetic source and to speed up the selection of a special－strain minipigs.Methods Boars anesthetized were preformed rectums electroejaculation with Lane Pulsator IV machine.The freeing method of sperms was directional freezing method(DFM)with different seeding ice duration(60 s)and different speeds of cooling(0.5～2.5mm/s).Results In cryopreservation with direct freezing method(DFM)，the parameters of 60 s seeding ice duration and 1.5mm/s cooling speed produced the better protection than others in the terms of the motility(61.7%)and acrosamal integrity of post thawed sperms.However，3% EG showed the deficient in potential of cryopreservation，though the acrosomal intergrity showed no difference with fresh sperms.The development potential of pronuclear embryos produced by the artificial insemination of frozen sperms with 60 s seeding duration and 1.5mm/s cooling speed was acceptable.Conclusion Directional freezing method can perform sperm cryopreservation and fertilization of ova in vivo and sequent embryos can develop to blastocyst stage.

Diannan miniature pig;Rectums electric ejaculate;Sperm cryopreservation;Directional freezing method;Artificial insemination

R332

B

1671－7856(2010)06－0061－05

2009－03－05

上海市科委項目(編號064909004);云南省教育廳項目(編號07Y10178)。

鄭紅，女，副教授，研究方向:實(shí)驗(yàn)動物學(xué)。

角建林。E－mail:zh1995097@yahoo.com.cn