異種動物血清對體外培養(yǎng)人腫瘤細胞生長的影響

趙秀梅，馮文茹，胡人杰

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

異種動物血清對體外培養(yǎng)人腫瘤細胞生長的影響

趙秀梅，馮文茹，胡人杰

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

目的 觀察不同種屬來源和濃度的動物血清對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞(A549、MCF－7、BGC－823)生長的影響。探討血清藥理實驗中血清供體動物的選擇及血清添加量的問題。方法 設(shè)置5種血清(牛、人、兔、大鼠、小鼠)及血清量(10%、20%、40%、60%、80%)的培養(yǎng)體系，用MTT法檢測細胞增殖情況。結(jié)果 不同種屬來源的動物血清對腫瘤細胞生長的影響作用各不相同。從總的趨勢來看，牛血清更適宜人腫瘤細胞生長，小鼠血清適應(yīng)性最差。且隨著加入量的增加，大多數(shù)血清會對腫瘤細胞的生長產(chǎn)生負效應(yīng)。結(jié)論 在腫瘤血清藥理學(xué)試驗中，為排除血清本身帶給試驗的干擾，應(yīng)測定正常動物血清對腫瘤細胞增殖的影響，且血清添加量以小于20%為宜。

血清;細胞;MTT

血清是細胞培養(yǎng)中最常用的添加成分，它是一種復(fù)雜的混合物，其中含有很多細胞生長所必需的營養(yǎng)成分和細胞因子。它不僅可以影響細胞的分化，而且對細胞的增殖也具有重要的意義。近年來隨著血清藥理學(xué)工作的廣泛開展，除牛血清之外其他種屬動物來源的血清也開始出現(xiàn)在細胞培養(yǎng)體系中。這就提出了一個問題，不同種屬的動物血清對于細胞的生長是否有不同的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，Beagle犬血清與胎牛血清對體外培養(yǎng)人肺癌細胞QG－56的生長無顯著性差異［1］。也有研究表明，在細胞培養(yǎng)體系中，不同種屬動物血清對細胞生長的影響似與其種屬親緣有關(guān)，親緣越接近的血清越適于該細胞生長［2］。我們結(jié)合當(dāng)前開展的腫瘤血清藥理學(xué)試驗工作，觀察了不同種屬來源的動物血清對體外培養(yǎng)的人腫瘤細胞生長的影響，以期為今后的研究工作提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物及血清:SPF級SD大鼠，SPF級ICR小鼠，均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供［SCXK(京)2006－2008］;新西蘭兔，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供［SCXK(京)2005－0002］。健康人血清，天津市第三中心醫(yī)院生化室惠贈。

1.1.2 細胞株:A549人肺癌細胞株，MCF－7人乳腺癌細胞株，BGC－823胃癌細胞株，由本單位瘤源室提供。

1.1.3 試劑:RPMI－1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自GIBCO公司;小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;MTT、二甲基亞砜(DMSO)均購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器:Wellscan MK 3酶聯(lián)檢測儀，Labsystems Dragon芬蘭產(chǎn);CO2孵箱，Heraeus美國產(chǎn);96孔板，Greiner德國產(chǎn);離心機:北京醫(yī)用離心機廠。

1.2 方法

1.2.1 血清的制備及滅活:動物予正常飲食，預(yù)適應(yīng)1周后，無菌條件下，大鼠自腹主動脈，小鼠自眼球后靜脈叢，兔從心臟取血，將采集到的血液樣本室溫靜置 1 h后，3000 r/min，離心20 min，分離血清，同種血清等量混合，56℃ 水浴滅活 30 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，置－20℃冰箱保存，2周內(nèi)使用。

1.2.2 MTT法檢測異種動物血清對細胞增殖的影響:取對數(shù)生長期細胞(A549、MCF－7、BGC－823)DHank’s液洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，離心，棄上清液，用 RPMI－1640培養(yǎng)液配成1×105個/mL單細胞懸液。于96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液，于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，棄去上清。每孔分別加入20、40、80、120和160 μL血清樣本(牛、人、兔、大鼠、小鼠)，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，余下用不含牛血清 RPMI－1640培養(yǎng)液補齊，使反應(yīng)總體積為 200 μL(血清濃度為 10%、20% 、40% 、60% 、80%)。37℃，5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。細胞培養(yǎng)完畢，棄上清，每孔加入MTT 溶液(0.25 mg/mL)200 μL，37℃ 繼續(xù)孵育 4 h，棄上清，每孔再加入150 μL二甲基亞砜，振蕩 10 min，酶標儀570 nm波長處測光密度(A)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SAS9.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及顯著性檢驗，所有實驗數(shù)據(jù)均以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 血清來源的種屬差異對腫瘤細胞生長的影響

從表1～3中可以看出，以牛血清對3種細胞生長影響較小。如在不同濃度，對于 A549和 BGC－823，牛血清組的A值與其他同濃度的血清組相比基本上是最高的。而對于MCF－7細胞，雖然牛血清組的細胞增殖能力不是最好的，但通過統(tǒng)計，從總的趨勢來看與同濃度A值最高的血清組相比較，并沒有顯著差異(P＞0.05)。相比而言，小鼠血清的影響就較大。如除了10%血清對 MCF－7細胞表現(xiàn)促進增殖的作用外，小鼠血清各濃度組對3種細胞生長基本上都是抑制作用。人、兔、大鼠的血清則對3種細胞生長影響作用居中。

表1 異種血清對A549細胞生長的影響(A值，n=5)Tab.1 The influence of different kinds of animal serum on A 549 cell line(A value，n=5)

表2 異種血清對MCF－7細胞生長的影響(A值，n=5)Tab.2 The influence of different kinds of animal serum on MCF－7 cell line(A value，n=5)

表3 異種血清對BGC－823細胞生長的影響(A值，n=5)Tab.3 The influence of different kinds of animal serum on BGC－823 cell line(A value，n=5)

2.2 血清添加量對腫瘤細胞生長的影響

總體而言，隨著加入量的增加，會對腫瘤細胞的生長產(chǎn)生負效應(yīng)。如小鼠血清對A549和MCF－7細胞，兔血清對MCF－7和BGC－823細胞以及大鼠血清對A549細胞，均隨濃度的增加，對細胞生長的抑制作用逐漸增強，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。血清濃度為10%時，相對小牛血清而言，出現(xiàn)“抑制”細胞生長的只有小鼠血清對 BGC－823細胞和大鼠血清對MCF－7細胞(P＜0.05)，當(dāng)血清提高到20%，這種“抑制性”影響的機會增加到6次之多，血清量再增加，這種“機會”均在7次以上。這從另一側(cè)面驗證了常規(guī)腫瘤細胞培養(yǎng)血清含量選擇10%是有道理的。

3 討論

隨著血清藥理學(xué)的運用，通過含藥血清進行體外研究比藥物直接接觸培養(yǎng)體系更具有體內(nèi)藥物作用的可擬性。因此，通過給培養(yǎng)體系加用含藥的血清進行研究日益受到重視。但常規(guī)制備的正常血清本身也會對培養(yǎng)體系具有作用，而且培養(yǎng)體系中的血清量越大，這種背景作用也越明顯，甚至當(dāng)血清濃度超過一定限度時會產(chǎn)生對培養(yǎng)體系的毒損作用［3］。而從本實驗結(jié)果來看，不同種屬的動物血清對人腫瘤細胞的作用濃度是有一定限制的，當(dāng)達到20%或更高時大多數(shù)表現(xiàn)出較為明顯的損傷特征。

另外，以往的相關(guān)研究中，楊樹青等［4］曾經(jīng)用不同種屬來源的血清(兔、大鼠、小鼠、豚鼠)來培養(yǎng)小鼠的肝細胞和HAC(小鼠腹水型肝癌)細胞，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的血清對細胞的損傷效應(yīng)與血清供體和靶細胞的親緣關(guān)系有關(guān)，它們之間的親緣關(guān)系越遠，損傷效應(yīng)的活性越高，同種血清則沒有明顯的作用。也有研究表明，血清對種屬來源相同或相近的細胞都表現(xiàn)出更好的增殖能力［2，5］。因此，在血清藥理學(xué)研究中，是否血清的供體與細胞的親緣關(guān)系越近，對實驗的整體影響就應(yīng)該越小，且其含藥血清的作用就更能明確的反映藥物作用，與體內(nèi)實驗也能表現(xiàn)出一定的相關(guān)性。但本次實驗的結(jié)果不同于前人的研究，并非種屬親緣關(guān)系越近越利于細胞生長，相比較而言以牛血清對細胞生長的影響較小，小鼠血清影響較大，人、兔、大鼠影響作用居中。我們考慮牛血清組細胞生長最佳的原因可能有二方面:一是長期培養(yǎng)的適應(yīng);二是小牛(胎牛)血清未接受免疫刺激，血清成分較為“單純”，而人血清的表現(xiàn)則可能是由于個體差異所致。

總之，從實驗結(jié)果來看，在血清藥理學(xué)研究中，應(yīng)特別注意對照組的設(shè)置，尤其是在選擇一些種屬動物進行實驗時更應(yīng)該引起重視。同時還必須進行正常血清及含藥血清的細胞毒實驗，以確定最大的給藥血清濃度，盡量減少血清本身帶給實驗的影響。

參考文獻:

［1］余宗陽，歐陽學(xué)農(nóng)，杜建，等.Beagle犬血清與胎牛血清生化特性及其對體外培養(yǎng)的人肺癌細胞生長的影響［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(5):26－30.

［2］吳健宇，穆靜，李儀奎.血清藥理實驗中異種動物血清對細胞的毒性作用和滅活后的減毒作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2000，16(1):118－119.

［3］秦英，楊君，姜良鐸，等.常規(guī)制備家兔血清對人臍靜脈內(nèi)皮細胞－304的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，21(11):845－848.

［4］楊樹青，王寶平，倪火洲.血清對異種細胞的損傷效應(yīng)［J］.上海免疫學(xué)雜志，1981，1(6):16－19.

［5］郭雄明，薛霞，謝中忱.兔血清制備及兔來源細胞培養(yǎng)實驗［J］.實驗動物科學(xué)與管理，2005，22(4):10－12.

The Influence of Different Kinds of Animal Serum on the Growth of Human Tumor Cells Cultured in Vitro

ZHAO Xiu－mei，F(xiàn)ENG Wen－ru，HU Ren－jie
(Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Science，Tianjin 300020，China)

Objective To observe the influence of serum in various species and concentrations on the growth of tumor cells(A549，MCF－7，BGC－823)for investigating the serum donators and added quantity in serum pharmacological experiment.Methods Five kinds(bovine，human，rabbit，rat，mouse)and concentrations(10% ，20% ，40% ，60% ，80%)of serum were set and MTT assay was applied to detect the growth of human tumor cells.Results The different species of serum on the growth of tumor cells was dissimilar.As a whole，the bovine serum was more suitable for human tumor cell growth and the worst the mouse serum.With the concentration of added serum increased，the majority of serum had a negative effect on the growth of tumor cells.Conclusions In order to avoid the interference by serum itself，the control animal serum on the effect of tumor cells should be measured when using serum pharmacological test method，and the added serum quantity is optimal for less 20%.

Serum;Cell;MTT

R965

A

1671－7856(2010)06－0035－04

2010－01－11

天津市衛(wèi)生局中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合科研課題(07038)。

趙秀梅(1975－)，女，助理研究員，碩士，從事中藥藥理和腫瘤藥理研究。E－mail:zxmmlg@eyou.com

胡人杰(1955－)，男，研究員，碩士生導(dǎo)師。E－mail:renjiehu@163.com