烏梅酸棗仁提取物對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的防治效果

李樹(shù)梅，張發(fā)明，李應(yīng)超，歐長(zhǎng)波，葉福芳，陳 慧，何 誠(chéng)

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193;2.北京市獸醫(yī)生物藥品廠，北京 102209;3.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 100107)

烏梅酸棗仁提取物對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的防治效果

李樹(shù)梅1，張發(fā)明2，李應(yīng)超3，歐長(zhǎng)波1，葉福芳1，陳 慧1，何 誠(chéng)1

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193;2.北京市獸醫(yī)生物藥品廠，北京 102209;3.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 100107)

目的 實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)烏梅酸棗仁提取物對(duì)雞致病性大腸桿菌病的療效。方法 根據(jù)前期研究自擬烏梅酸棗仁提取物配方，以體外試管二倍稀釋法測(cè)定其最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，建立雞致病性大腸桿菌病模型，評(píng)價(jià)其預(yù)防和治療雞大腸桿菌病療效。結(jié)果 體外試驗(yàn)顯示其最小抑菌濃度為12.5 mg/mL;人工感染雞大腸桿菌病模型顯示預(yù)防試驗(yàn)中烏梅酸棗仁提取物高、中、低劑量組、利好對(duì)照組、感染對(duì)照組的成活率分別為50%、70%、50%、60%、10%;肝臟細(xì)菌檢出率均為 100%。治療試驗(yàn)中上述各組成活率分別為62.5%、50%、37.5%、62.5%、25%;肝臟細(xì)菌檢出率均為100%。結(jié)論 體外、體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，烏梅酸棗仁提取物能有效減少人工感染后的臨床癥狀，保護(hù)率為50%～70%，推薦使用劑量為200 mg/kg體重，可以替代部分抗生素防治此病。

烏梅酸棗仁提取物;雞大腸桿菌病;體外試驗(yàn);體內(nèi)試驗(yàn)

烏梅(Fructus mume)是由薔薇科植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.干燥近成熟的果實(shí)加工而成［1］。研究表明，濃度為1.44 mg/mL的烏梅水煎劑可以使28株大腸桿菌100%受到抑制［2］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)其醇浸漬液對(duì)沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌作用敏感［3］。酸棗仁為鼠李科植物酸棗 Ziziphus jujuba Mill.var.spiona(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種仁［1］，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)酸棗仁皂苷具有明顯的免疫調(diào)節(jié)和抗組胺釋放的活性，主要應(yīng)用于鎮(zhèn)靜和催眠作用以及抗驚厥作用，也用于血管保護(hù)及免疫增強(qiáng)［4，5］。前期研究顯示烏梅提取物具有抗禽流感(H9亞型)病毒活性、抗新城疫病毒活性以及抗雞傳染性法氏囊病病毒活性［6］。從烏梅中提取得到的化合物V對(duì)于肉雞大腸桿菌病具有較好的預(yù)防保護(hù)效果［7］，酸棗仁乙醇提取物對(duì)于肉雞實(shí)驗(yàn)感染大腸桿菌病具有較好的防治效果，保護(hù)率優(yōu)于硫酸新霉素［8］。烏梅提取物Q和酸棗仁提取物S1能明顯降低雞毒霉形體的發(fā)病率、減少氣囊的損傷［9］。烏梅酸棗仁提取物由烏梅、酸棗仁提取物組成，經(jīng)過(guò)不同比例篩選而成，具有成本低、療效高、安全性高的特點(diǎn)。

大腸桿菌病是由致病性血清型大腸桿菌引起的一種雞的常見(jiàn)傳染病，不同品種不同日齡的雞均可感染，臨床防治措施主要依賴使用大量的抗生素。大量抗生素濫用導(dǎo)致藥物敏感性下降、耐藥性增加以及藥物殘留，嚴(yán)重影響著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，威脅動(dòng)物性食品安全。因此，烏梅酸棗仁提取物對(duì)耐藥性大腸桿菌有效，無(wú)殘留、安全綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)旨在探討人工感染致病性大腸桿菌后，烏梅酸棗仁提取物是否具有預(yù)防和治療價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、牛肉浸膏、麥康凱干粉培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。麥康凱平板按常規(guī)法制備，滅菌后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

158只18日齡的健康海蘭褐雞，由河北省高碑店市富強(qiáng)種雞孵化場(chǎng)提供。飼養(yǎng)管理按照種雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)進(jìn)行常規(guī)飼喂。

1.3 藥物

利好(20%復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉可溶性粉):由某動(dòng)物保健有限公司贈(zèng)送，批號(hào)2008102409。以滅菌生理鹽水配制成最終濃度為15 mg/mL的口服溶液。

烏梅、酸棗仁:購(gòu)自河北省安國(guó)中藥材批發(fā)市場(chǎng)。烏梅酸棗仁提取物濃度為200 mg/mL，其中每毫升藥液中含有烏梅酸棗仁提取物200 mg，由實(shí)驗(yàn)室制備。

1.4 菌種

致病性雞大腸桿菌從臨床患病雞肝臟分離獲得，經(jīng)生化試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)鑒定為臨床致病性大腸桿菌，血清型為O15(大腸桿菌單因子血清來(lái)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所保存。

1.5 體外試驗(yàn)

最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定:采用試管二倍稀釋法［10］測(cè)定烏梅酸棗仁提取物對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)。取11支滅菌具塞試管，每只試管中各加入滅菌肉湯2mL。第1管加入滅菌藥液2mL，混勻后取2mL放至第2管中，依次倍比稀釋至第9管，第10管作為陽(yáng)性對(duì)照不加藥液，第11管作為感染對(duì)照加入提取物2mL混勻后棄去2mL。于1～10管中加入2mL大腸桿菌菌液，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日觀察結(jié)果。眼觀選出無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的各管，分別取其液體涂布于瓊脂平板培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。為消除藥物本身的影響，將不能完全確定的試管液體轉(zhuǎn)接于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，次日觀察平皿中有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。為消除試驗(yàn)偶然性，確定其重復(fù)性及可靠性，將本試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.6 體內(nèi)試驗(yàn)

1.6.1 雞致病性大腸桿菌LD50的測(cè)定:將50只18日齡的雞隨機(jī)分成5組，分別為4×109CFU組，4×108CFU組，4×107CFU組，4×106CFU組，空白對(duì)照組，每組10只。每只腹腔注射菌液0.5mL。觀察每組雞的死亡率，確定大腸桿菌的LD50。

1.6.2 試驗(yàn)分組:預(yù)防、治療試驗(yàn)分組情況一致，均將18日齡的雞隨機(jī)分為6組，分別是烏梅酸棗仁提取物高、中、低劑量組、利好對(duì)照組、感染對(duì)照組(感染對(duì)照組)，空白對(duì)照組，預(yù)防試驗(yàn)每組10只，治療試驗(yàn)每組8只。

1.6.3 攻毒和給藥方式［7］:腹腔注射菌液，0.5mL/只。預(yù)防試驗(yàn)按照口服灌胃給藥3 d后攻毒，之后再給藥3 d。治療試驗(yàn)按照攻毒后給藥，連續(xù)給藥5 d，分上、下午兩次。其中預(yù)防用藥減半，停藥觀察3 d后剖檢。分組及給藥情況詳見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)分組及給藥Tab.1 The test groups and dosages with the herb medicines

1.6.4 療效評(píng)價(jià):大腸桿菌感染標(biāo)準(zhǔn):腹腔氣囊出現(xiàn)纖維素滲出，肝臟被膜出現(xiàn)滲出，心包炎，判斷為大腸桿菌感染死亡。發(fā)病率:接種細(xì)菌后表現(xiàn)為精神不振、扎堆、縮頸、排黃白稀糞等癥狀的雞數(shù)與該組總數(shù)比值。死亡率:試驗(yàn)期間，剖檢觀察出現(xiàn)大腸桿菌病典型癥狀并導(dǎo)致死亡，死亡率即發(fā)生死亡的雞數(shù)與該組總數(shù)的比值。相對(duì)增重率:根據(jù)試驗(yàn)開(kāi)始及結(jié)束時(shí)每只雞的體重，計(jì)算增重及每組雞的平均增重，并以空白對(duì)照組增重為100%，各組增重與之相比得到各組相對(duì)增重率。大腸桿菌檢出率:試驗(yàn)結(jié)束后剖檢存活雞，取肝臟分離培養(yǎng)和鑒定大腸桿菌，統(tǒng)計(jì)肝臟大腸桿菌陽(yáng)性檢出率。

1.6.5 數(shù)據(jù)的分析與處理:采用SPSS(13.0)統(tǒng)計(jì)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用(±s)表示。其中死亡率、成活率均用卡方檢驗(yàn)，相對(duì)增重率采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 最小抑菌濃度的確定

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)烏梅酸棗仁提取物具有一定的體外抑菌作用，最小抑菌濃度為12.5 mg/mL(表2)。

表2 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination of minimal inhibitory concentration in the chickens with the pathogenically E.coli strain

2.2 半數(shù)致死量的確定

各試驗(yàn)組動(dòng)物在腹腔注射菌液后，于12 h內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)精神遲鈍，垂翅，呆立，食欲減少等癥狀。死亡多發(fā)生于接種后24～48 h，對(duì)照組無(wú)死亡。以Karber法計(jì)算半數(shù)致死量，即lg LD50=L+d×(S－0.5)，其中L為最低稀釋度的對(duì)數(shù);d為組距(稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù));S為死亡比值之和，由此可以確定半數(shù)致死量為4×108CFU(表3)。

表3 雞人工感染致病性大腸桿菌LD50測(cè)定Tab.3 Determination of LD50in chickens with the pathogenically E.coli strain

2.3 預(yù)防試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 口服藥物后對(duì)雞增重的影響:高、中、低劑量組的相對(duì)增重率分別為36.25%、34.76%和11.3%，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，利好對(duì)照組為27.43%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明:高、中、低三個(gè)劑量組以及利好對(duì)照組的相對(duì)增重率均顯著高于感染對(duì)照組(P＜0.05)(表4)。

2.3.2 口服藥物后對(duì)發(fā)病率、成活率的影響:人工感染大腸桿菌7 d后，感染對(duì)照組成活率10%，烏梅酸棗仁提取物中劑量組成活率為70%，差異顯著(P＜0.05)(表5)。

2.4 治療試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 口服藥物后對(duì)雞增重的影響:高、中、低劑量組的相對(duì)增重率分別為33.81%、40.21%和103.09%，利好對(duì)照組為 98.97%，與感染對(duì)照組(71.34%)相比較，差異不顯著(表6)。

表4 預(yù)防實(shí)驗(yàn)中口服藥物對(duì)雞增重的影響Tab.4 Effects of the herb medicine on body weight in the prophylaxis experiment

表5 口服藥物后對(duì)發(fā)病率、成活率的影響Tab.5 The effect of herb medicines on the chicken morbidity，mortality and bacterial clearance in curtio experiment

表6 口服藥物后對(duì)雞增重的影響Tab.6 The effects of herb medicine on body weight gain

2.4.2 口服藥物后對(duì)發(fā)病率、成活率的影響:人工感染大腸桿菌7 d后，烏梅酸棗仁提取物三個(gè)劑量組成活率分別為62.5%，50%，37.5%，利好對(duì)照組為62.5%，均明顯高于感染對(duì)照組(25%)，但差異不顯著。肝臟細(xì)菌分離率均為100%(表7)。

表7 口服藥物后對(duì)發(fā)病率、成活率的影響Tab.7 The effects of the herb medicines on morbidity，mortality and bacterial clearance in curatio experiment

3 討論

3.1 烏梅酸棗仁提取物體外、體內(nèi)對(duì)雞大腸桿菌療效評(píng)價(jià)

體外試驗(yàn)結(jié)果顯示烏梅酸棗仁提取物具有較好的抑菌效果，最小抑菌濃度達(dá)到12.5 mg/mL。體內(nèi)采用人工感染大腸桿菌，預(yù)防試驗(yàn)結(jié)果顯示其相對(duì)增重率呈效應(yīng)－劑量關(guān)系，高、中、低三個(gè)劑量組的相對(duì)增重率分別為36.25%、34.76%和11.3%，增重效果均明顯高于感染對(duì)照組(負(fù)增重30.56%)，且差異顯著(P＜0.05)。其中高、中劑量組(36.25%、34.76%)的增重效果優(yōu)于陽(yáng)性(利好)對(duì)照組(27.43%)。在成活率方面，三個(gè)劑量組的成活率也明顯高于感染對(duì)照組(10%)，中劑量組的成活率(70%)與感染對(duì)照組相比較差異顯著(P＜0.05)。在治療實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)烏梅酸棗仁提取物高、中、低三個(gè)劑量組的成活率呈效應(yīng)－劑量關(guān)系，成活率分別為62.5%、50%和37.5%，明顯高于感染對(duì)照組(25%)，其中高劑量組的成活率與陽(yáng)性(利好)對(duì)照組(62.5%)相當(dāng)。

根據(jù)《中國(guó)獸藥典》2005版烏梅項(xiàng)下規(guī)定可知，烏梅中檸檬酸含量不得少于15.0%，同時(shí)含有大量的蘋(píng)果酸，這說(shuō)明烏梅中含有大量的有機(jī)酸。在動(dòng)物機(jī)體能量代謝中，檸檬酸是動(dòng)物體內(nèi)糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物，是糖有氧氧化過(guò)程中三羧酸循環(huán)的起始物［11］。另外一個(gè)防治雞毒支原體實(shí)驗(yàn)中，口服烏梅、酸棗仁提取物可以顯著增加血液中白細(xì)胞總數(shù)和單核細(xì)胞數(shù)量，從而增強(qiáng)感染雞的細(xì)胞免疫功能。這提示烏梅酸棗仁提取物可能通過(guò)提高家禽機(jī)體非特異性免疫力達(dá)到保護(hù)家禽免受大腸桿菌的侵害，而非通過(guò)殺滅或抑制機(jī)大腸桿菌途徑。因此，實(shí)驗(yàn)顯示不能完全清除肝臟中大腸桿菌。另一方面，口服烏梅酸棗仁提取物后能顯著增加體重，這說(shuō)明該藥物通過(guò)增加感染雞的采食量，增強(qiáng)非特異性免疫功能達(dá)到抵抗細(xì)菌感染的目的。

3.2 烏梅酸棗仁提取物防治雞大腸桿菌潛在的市場(chǎng)價(jià)值

當(dāng)前畜禽養(yǎng)殖業(yè)控制大腸桿菌病主要依賴抗菌素，同時(shí)大量抗菌素的濫用導(dǎo)致大腸桿菌出現(xiàn)耐藥性，加劇了細(xì)菌性傳染病防治難度。另一方面藥物殘留也嚴(yán)重影響我國(guó)肉雞出口產(chǎn)業(yè)，嚴(yán)重危害著我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，威脅人類食品安全和身體健康等。

烏梅酸棗仁提取物具有毒副作用小、資源豐富、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，其中烏梅主產(chǎn)地在四川、福建和浙江3省，酸棗仁則主要分布在西北、東北、華北許多省區(qū)及南方的一些地區(qū)。在實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中和臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其適口性比較好，可以顯著增加肉雞的采食量，這有別于其它中藥適口性。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)烏梅酸棗仁提取物預(yù)防效果與知名合資獸藥－利好相當(dāng)，這也說(shuō)明利用烏梅酸棗仁提取物有可能部分替代目前的抗生素，解決當(dāng)前耐藥性性大腸桿菌問(wèn)題，保障動(dòng)物性食品安全。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示烏梅酸棗仁提取物按200 mg/kg體重口服，連續(xù)使用5 d，可以有效防治致病性大腸桿菌人工感染，增加采食量，提高增重。

［1］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典［S］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006.

［2］李仲興，王秀華，李繼紅，等.烏梅對(duì)308株臨床菌株的抑菌效果［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(11):41－42.

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［5］陳百泉，杜鋼軍，許啟泰.酸棗仁皂苷的鎮(zhèn)靜催眠作用［J］.中藥材，2002，25(6):429－430.

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Prevention and Cure Effects of Fructus mume and Semen ziziphi spinosae Extract against Chicken Colibacillosis

LI Shu－mei1，ZHANG Fa－ming1，LI Ying－chao1，OU Chang－bo1，YE Fu－fang1，CHEN Hui1，HE Cheng1
(1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China;2.Beijing Veterinary Biological Products Factory，Beijing 102209，China;3.Beijing Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100107，China)

Objective To assess the pharmacological effects of Fructus mume and Semen ziziphi spinosae extract against avian colibacillosis.Methods Fructus mume and Semen ziziphi spinosae extract was manufactured according to the previous study.Minimal Inhibitory Concentration(MIC)was determined by two－fold dilution method in vitro.Chickens administered orally with the solution were challenged with virulent E.coli strain in vivo.Results The MIC of Fructus mume and Semen ziziphi spinosae extract was determined to be 12.5 mg/mL.In prophylaxis test，the bird survival rate was 50%，70%，50%，60%and 10%，respectively in higher dose，medium and low dose group，positive group and negative group while all infected livers were positive for the isolated E.coli.In other cure experiment，the survival rate was 62.5% ，50%，37.5%，62.5%and 25%%，respectively in above mentioned groups.Meanwhile，positive E.coli was determined to be 100%in the infected chicken livers.Conclusions The infected chickens were able to get 50%～70%protection with 200 mg/kg。The herb oral solution is promising to replace the commercial antibiotics in control avian colibacillosis.

Fructus mume and Semen ziziphi spinosae extract;Avian colibacillosis;In vivo;In vitro

S858.31

A

1671－7856(2010)06－0049－05

2010－01－11

李樹(shù)梅(1984－)，女，碩士生，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。

何誠(chéng)(1966－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。E－mail:hehonest@yahoo.com.cn