熟地黃多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠的抗突變作用研究

梁穎，徐紹娜，徐放，李明珠，黃寅炎，吳勃巖

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

地黃為玄參科植物地黃(Radix Rehmanniae PreParata)的新鮮或干燥塊莖。熟地黃是生地的炮制品，是中醫(yī)常用的補(bǔ)肝腎、益精血之品，具有補(bǔ)血滋陰、益精填髓的功效，是優(yōu)良的滋陰補(bǔ)血藥，被譽(yù)為“壯水之主，補(bǔ)血之君”，廣泛用于陰虛、血虛所致的各種疾病。多糖是地黃中有效成分之一，有資料表明，熟地黃多糖具有抗氧化，抗衰老［1］，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用［2，3］。但關(guān)于熟地黃多糖在抗突變方面的文獻(xiàn)的報(bào)道還很少。本實(shí)驗(yàn)通過三種常用的抗突變?cè)囼?yàn)，研究熟地黃多糖的抗突變作用，為其進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供。

1.2 藥品與試劑 熟地黃(購于同仁堂);熟地黃多糖(由本實(shí)驗(yàn)室提取并鑒定);環(huán)磷酰胺(上海華聯(lián)制藥有限公司);秋水仙素(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);5－BrdU(南京探求生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)劑量 經(jīng)抑瘤試驗(yàn)證明，熟地黃多糖給藥量為500mg·kg－1時(shí)為最佳劑量，效果最為顯著。以下試驗(yàn)均采用此劑量。

1.3.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核試驗(yàn) 選取20～22g的昆明種小鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分成3組，每組10只。陰性對(duì)照組，灌胃給生理鹽水，10d。熟地多糖組，按表1的劑量灌胃給藥10d。陽性對(duì)照組，第1～8d口服生理鹽水，第9、10d腹腔注射環(huán)磷酰胺(40mg·kg－1)。第10d給環(huán)磷酰胺6h后，處死小鼠。取股骨骨髓細(xì)胞，常規(guī)制片，Giemsa染色，油鏡下觀察。每只小鼠統(tǒng)計(jì)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，并記錄出微核細(xì)胞數(shù)。采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)算抑制率:

抑制率=［(陽性組出現(xiàn)數(shù)－實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)數(shù))/陽性組出現(xiàn)數(shù)］×100

1.3.3 小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) 選取20～22g的昆明種小鼠30只，雌雄各半，分組及給藥情況同微核試驗(yàn)。第10d陽性對(duì)照組注射完環(huán)磷酰胺后2h，將所有小鼠全部腹腔注射秋水仙素(4mg·kg－1)，4h后處死小鼠。取小鼠股骨骨髓細(xì)胞，37℃ KCl溶液中低滲處理30min。甲醇冰醋酸固定2次，制片，Giemsa染色，油鏡下觀察。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞分裂相，并記錄出染色體畸變的細(xì)胞數(shù)，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)算抑制率。

1.3.4 小鼠骨髓細(xì)胞姐妹染色單體交換試驗(yàn) 選取20～22g昆明種小鼠30只，雌雄各半，分組及給藥情況同微核試驗(yàn)。所有小鼠在處死前24h，分12次腹腔注射5－BrdU，1mg·g－1。處死前4h腹腔注射秋水仙素。處死后取股骨骨髓細(xì)胞，低滲處理和固定過程同染色體畸變實(shí)驗(yàn)。制片后將裝片于37℃恒溫箱內(nèi)放置3d，將分化好的裝片置于30W的紫外燈下照射30min，自然晾干，Giemsa染色，油鏡下觀察。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞分裂相，并記錄出現(xiàn)交換的染色體數(shù)。采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果

2.1 熟地黃多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)微核的影響

熟地黃多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞PCE微核率具有抑制作用。與陽性對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.01)，抑制率為37.87%。與陰性對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表1。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熟地黃多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠微核率有顯著的抑制作用。

2.2 熟地黃多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變的影響

熟地黃多糖組與陽性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)，抑制率為21.46%，與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明熟地黃多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的染色體畸變有良好的抑制作用。結(jié)果見表2。

2.3 熟地黃多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞姐妹染色單體交換率的影響

熟地黃多糖組與陽性對(duì)照組比較存在差異(P<0.05)，抑制率為25.61%，與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表3。表明熟地黃多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞姐妹染色單體交換率有一定的抑制作用。

表1 熟地黃多糖對(duì)CP誘導(dǎo)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的影響(±s)

表1 熟地黃多糖對(duì)CP誘導(dǎo)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的影響(±s)

注:與陽性對(duì)照組比較，**P<0.01;與陰性對(duì)照組比較，##P<0.01。

組別 熟地黃多糖(mg·kg－1) CP(mg·kg－1) 動(dòng)物數(shù)(只) PCE(個(gè)) 微核率(‰) 抑制率(%)陰性對(duì)照組10 1000 2.20±0.25 －陽性對(duì)照組 － 40 10 1000 63.9±5.74 －熟地黃多糖組 500 40 10 1000 39.7±6.74**##－－37.87

表2 熟地黃多糖對(duì)CP誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變的影響(±s)

表2 熟地黃多糖對(duì)CP誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變的影響(±s)

注:與陽性對(duì)照組比較，**P<0.01;與陰性對(duì)照組比較，##P<0.01。

組別 熟地黃多糖(mg·kg－1) CP(mg·kg－1) 動(dòng)物只數(shù)(只) 骨髓細(xì)胞(個(gè)) 染色體畸變率(%) 抑制率(%)陰性對(duì)照組10 100 12.00±1.92 －陽性對(duì)照組 － 40 10 100 54.33±4.32 －熟地黃多糖組 500 40 10 100 42.67±3.93**##－－21.46

表3 熟地黃多糖對(duì)CP誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞姐妹染色單體交換的影響(±s)

表3 熟地黃多糖對(duì)CP誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞姐妹染色單體交換的影響(±s)

注:與陽性對(duì)照組比較，*P<0.05;與陰性對(duì)照組比較，##P<0.01。

組別 熟地黃多糖(mg·kg－1) CP(mg·kg－1) 動(dòng)物只數(shù)(只) 細(xì)胞數(shù)(個(gè)) 姐妹染色單體交換率(%) 抑制率(%)陰性對(duì)照組10 30 3.50±1.87 －陽性對(duì)照組 － 40 10 30 10.25±1.67 －熟地黃多糖組 500 40 10 30 7.62±1.68*##－－25.61

3 討論

熟地黃是中醫(yī)臨床常用藥，為補(bǔ)陰補(bǔ)血佳品。在熟地黃中，多糖的含量為3.33%［4］。除多糖外，還有梓醇、苷類、5－羥甲基糠醛等成分。有資料表明，熟地黃多糖具有抗氧化、抗衰老的作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，低分子量的地黃多糖還具有抑瘤作用［5］。

本試驗(yàn)證明，熟地黃多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的微核率有良好的抑制作用，可以有效地避免微核的發(fā)生，減少染色體的損傷。同時(shí)熟地黃多糖還對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞染色體畸變率和姐妹染色單體交換率有明顯的抑制作用。因此，我們可以推測(cè)熟地黃多糖可以通過抵抗誘變劑對(duì)染色體造成的損傷，來達(dá)到對(duì)機(jī)體遺傳物質(zhì)的保護(hù)作用，避免突變的發(fā)生，最終起到抗腫瘤作用。同時(shí)也表明，熟地黃多糖對(duì)遺傳物質(zhì)無損害作用。熟地黃多糖抗突變的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

［1］ 陳丁丁，戴培德，張濤.地黃煎劑消退L－甲狀腺素誘發(fā)的大鼠心肌肥厚并抑制其升高的心、腦線粒體 Ca2+、Mg2+ATP酶活力［J］.中藥藥理與臨床，1997，13(4):27 －29.

［2］ 苗明三.懷地黃多糖對(duì)衰老模型小鼠免疫器官的影響［J］.河南中醫(yī)，1999，19(3):30.

［3］ 苗明三，方曉艷.懷地黃多糖免疫興奮作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2002，9(3):159 －160.

［4］ 紀(jì)耀華，孫瑩.地黃炮制前后總多糖含量的比較［J］.中醫(yī)藥信息，1999，16(4):16 －17.

［5］ 魏小龍，茹祥斌.低分子量地黃多糖對(duì)P53基因表達(dá)的影響［J］.中國藥理學(xué)學(xué)報(bào)，1997，18(5):471 －474.