氮元素對(duì)發(fā)菜生長(zhǎng)及多糖含量的影響

湯 俊，萬 能，胡征宇*

氮元素對(duì)發(fā)菜生長(zhǎng)及多糖含量的影響

湯 俊1,2，萬 能2，胡征宇1,*

(1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，湖北 武漢 430072；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程系，江蘇 常熟 215500)

為優(yōu)化培養(yǎng)條件，研究含氮(BG11)和無氮(BG110)培養(yǎng)基對(duì)發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)的色素、藻膽蛋白及胞內(nèi)多糖和胞外多糖(EPS)含量的影響。結(jié)果顯示：含氮組發(fā)菜的葉綠素a(Chl a)、類胡蘿卜素(Carotenoids)、藻藍(lán)蛋白(PC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)、藻紅蛋白(PE)的含量均顯著高于無氮組；胞內(nèi)及胞外多糖含量無氮組高于含氮組，兩者胞內(nèi)多糖含量最大分別為1.03mg/mL和0.78mg/mL，EPS含量最大分別為243.8μg/mL和74.9μg/mL。表明氮元素的缺乏對(duì)發(fā)菜的色素合成有抑制作用，但在一定程度上能夠促進(jìn)胞內(nèi)及胞外多糖的合成和分泌。

發(fā)菜；氮；多糖；藻膽蛋白

發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)是一種固氮藍(lán)藻，其群體多呈墨綠色絲狀，主要分布于我國(guó)北方及西北干旱和半干旱地區(qū)[1]。發(fā)菜含有較高含量的多糖、蛋白及必需氨基酸，并且對(duì)于高血壓、甲狀腺腫大等疾病有一定的治療作用，在我國(guó)作為食品和草藥已有上千年的歷史[2]。多糖是一類具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖及免疫促進(jìn)等活性作用的生物大分子[3-6]。關(guān)于多糖活性的研究已有許多報(bào)道，如發(fā)菜多糖能夠清除超氧陰離子自由基和羥自由基[5]，螺旋藻多糖能夠抑制癌細(xì)胞增殖[7-9]等。有研究證明，藻膽蛋白也同樣具有清除自由基、抑制癌細(xì)胞和病毒增殖的作用[9-11]。本實(shí)驗(yàn)研究氮元素對(duì)發(fā)菜的生長(zhǎng)、藻膽蛋白及多糖等組分含量的影響，為優(yōu)化培養(yǎng)條件和多糖等功能性物質(zhì)的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)條件

發(fā)菜(N.flagelliforme，F(xiàn)ACHB-818)來自中科院水生生物研究所典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻體進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。溫度為(27±2)℃，光照強(qiáng)度為28μE/(m2·s)，通氣培養(yǎng)。BG11培養(yǎng)基配方參照Rippka等[12]的方法，BG110為不含NaNO3的BG11培養(yǎng)基。

1.2 葉綠素和類胡蘿卜素含量的測(cè)定

藻樣經(jīng)離心棄上清液。藻體加入無水甲醇，避光60℃水浴1h。離心取上清液分別測(cè)定波長(zhǎng)665nm、649nm和450nm處吸光度[13]。根據(jù)下列公式計(jì)算葉綠素含量(CChla)及類胡蘿卜素(CCarotenoids含量)。

1.3 藻膽蛋白含量的測(cè)定

取藻樣，離心棄上清，藻體經(jīng)暗處研磨后加入磷酸緩沖液(0.05mmol/mL，pH7.2)。－20℃反復(fù)凍融以充分提取藻藍(lán)蛋白，分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)615、652nm及562nm處的吸光度[13]。根據(jù)下列公式分別計(jì)算藻膽蛋白各組分的含量。

1.4 胞內(nèi)多糖含量的測(cè)定

藻樣經(jīng)蒸餾水清洗后研磨，然后再加入蒸餾水于95℃水浴3h。離心取上清，采用苯酚硫酸法在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度，參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算多糖含量。

1.5 胞外多糖的測(cè)定及可見光區(qū)吸收光譜掃描

藻樣離心后取上清液，用蒸餾水進(jìn)行4倍稀釋，稀釋后的溶液采用苯酚硫酸法顯色測(cè)定多糖含量，并在波長(zhǎng)400～800nm之間掃描吸收光譜。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Origin 7.0處理，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮元素對(duì)發(fā)菜葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

圖1 氮元素對(duì)發(fā)菜葉綠素(A)和類胡蘿卜素(B)含量的影響Fig.1 Effect of nitrogen on the contents of Chl a and carotenoids of N. flagelliforme

如圖1所示，在含氮和無氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的發(fā)菜，其兩種色素的含量均顯著增高，但在培養(yǎng)后期，無氮組的色素含量上升趨勢(shì)明顯低于含氮組。其中，BG11培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)20d的葉綠素和類胡蘿卜素含量分別為27.5mg/mL和7.2mg/mL，而BG110組為11.2mg/mL和2.9mg/mL。色素含量一般可用作衡量微藻生物量變化的指標(biāo)，從結(jié)果可以看出，培養(yǎng)基中提供氮源與否，發(fā)菜都能夠生長(zhǎng)，但生物量的快速增加需要充足的氮源供應(yīng)。

2.2 氮元素對(duì)發(fā)菜藻膽蛋白含量的影響

圖2 氮元素對(duì)發(fā)菜藻藍(lán)蛋白(A)、別藻藍(lán)蛋白(B)及藻紅蛋白(C)含量的影響Fig.2 Effect of nitrogen on the contents of PC, APC and PE of N. flagelliforme

藻膽蛋白包含藻藍(lán)蛋白(PC)、藻紅蛋白(PE)和別藻藍(lán)蛋白(APC)，是藍(lán)藻重要的輔助捕光色素系統(tǒng)，在光合作用中起著吸收和傳遞能量的重要作用。如圖2所示，BG11和BG110培養(yǎng)的發(fā)菜，其藻膽蛋白各組分的含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，其中PC含量最高，其次為APC和PE。在培養(yǎng)至20d時(shí)，BG11和BG110組的PC含量分別為395.5、33.4μg/mL；APC含量分別為153.4、38.0μg/mL；PE含量分別為50.3、25.7μg/mL。BG11組藻膽蛋白含量比BG110組高出61.7%，說明培養(yǎng)基中提供氮元素有利于發(fā)菜藻膽蛋白的合成。

2.3 氮元素對(duì)發(fā)菜多糖含量的影響

圖3 氮元素對(duì)發(fā)菜胞內(nèi)多糖(A)和EPS(B)含量的影響Fig.3 Effect of nitrogen on the contents of endo- and exopolysaccharides of N. flagelliforme

由圖3可知，在培養(yǎng)前期，BG11組培養(yǎng)的發(fā)菜胞內(nèi)多糖含量低并且與BG110組差異不顯著，但培養(yǎng)至15d時(shí)，BG110組發(fā)菜多糖含量迅速增加并顯著高于BG11組的發(fā)菜多糖含量。第20天時(shí)，胞內(nèi)多糖含量分別為BG110組1.03mg/mL和BG11組0.78mg/mL(圖3)。在培養(yǎng)至第15天時(shí)，可檢測(cè)到較高含量的胞外多糖(EPS)，并且BG110組含量高于BG11組。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，含量差異顯著增大，最大含量分別為BG110組243.8μg/mL和BG11組74.9μg/mL。這說明與提供充足氮源相比，氮元素的缺乏更能有效的促進(jìn)多糖，尤其是胞外多糖的合成與分泌。2.4胞外多糖的吸收光譜

如圖4A顯示，BG110培養(yǎng)的發(fā)菜，其胞外物質(zhì)在波長(zhǎng)490nm處有特征吸收峰，說明主要成分為多糖，并且含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加。BG11組(圖4B)的發(fā)菜在培養(yǎng)初期，雖然在波長(zhǎng)490nm處有吸光度，但沒有典型的吸收峰，說明此階段并沒有胞外多糖的分泌。隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，波長(zhǎng)490nm的典型吸收峰出現(xiàn)并且愈發(fā)明顯，表明此階段有胞外多糖的分泌，而且含量逐漸增加，但含量明顯低于BG110組，這與多糖含量結(jié)果相一致，同時(shí)再次表明氮元素的缺乏能夠促進(jìn)胞外多糖的分泌。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間和不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的發(fā)菜胞外多糖的吸收光譜Fig.4 Visible absorption spectra of Nostoc flagelliforme cultivated in BG11 and BG110 for different days

3 討 論

糖類物質(zhì)除了顯著的藥用活性外還具有許多其他重要的生物學(xué)功能，特別是在與其所生長(zhǎng)環(huán)境之間的相互作用中，糖類的合成有十分特殊的意義。有研究認(rèn)為，在機(jī)體抵抗環(huán)境的脅迫中，保持細(xì)胞膜的完整性最為重要，而研究證明，藍(lán)藻中對(duì)細(xì)胞膜保護(hù)功能最明顯的就是糖物質(zhì)[14]。胞外多糖的豐富合成是念珠藻的重要特征之一，其最基本的生物學(xué)功能是保持水分，這種功能對(duì)于生長(zhǎng)于沙漠地帶的發(fā)菜來說意義重大。正是由于多糖具有如此多的生物學(xué)意義，多糖與其限制因素的研究越來越受到重視。

氮是藻類生長(zhǎng)繁殖必不可少的營(yíng)養(yǎng)因子，是細(xì)胞代謝中形成氨基酸、嘌呤、嘧啶、卟啉、氨基糖等物質(zhì)的基本元素，其種類及其濃度的變化，都可以影響到藻類的色素、蛋白和多糖的合成[15-16]。

研究發(fā)現(xiàn)，BG110培養(yǎng)下，發(fā)菜葉綠素及藻膽蛋白的含量遠(yuǎn)低于BG11組，說明無機(jī)氮源(NO3)的缺失對(duì)發(fā)菜的生長(zhǎng)有抑制作用。雖然發(fā)菜可以固氮，但這是個(gè)非常耗能的過程，無法提供給細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)充足的氮源會(huì)影響發(fā)菜的生長(zhǎng)狀況[17]。

Spoer等[18]研究發(fā)現(xiàn)，小球藻(Chlorella vulgaris)在氮缺乏時(shí)會(huì)導(dǎo)致糖含量的增加，但以蛋白質(zhì)的降低作為代價(jià)。Kroen等[19]發(fā)現(xiàn)氮缺失時(shí)，墨西哥衣藻(Chlamydomonas mexicana)會(huì)增加糖的積累，這與本實(shí)驗(yàn)獲得的胞內(nèi)及胞外多糖的含量均為無氮培養(yǎng)組較高的結(jié)果相一致。

培養(yǎng)基中NO3對(duì)糖含量的檢測(cè)有干擾[20]，因此本實(shí)驗(yàn)除了利用常規(guī)方法測(cè)定糖含量外，還進(jìn)行了EPS的掃描檢測(cè)。結(jié)果顯示，在BG110培養(yǎng)基中多糖的典型吸收峰顯著，并且含量隨時(shí)間的增加而升高，說明在培養(yǎng)基中氮的缺乏可促進(jìn)發(fā)菜分泌EPS，但含量低于胞內(nèi)多糖的合成量。

發(fā)菜因與發(fā)財(cái)諧音，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在東南沿海和部分海外地區(qū)被視為重要的節(jié)日饋贈(zèng)禮品，也是我國(guó)重要出口物資之一[17]。近半個(gè)世紀(jì)來，發(fā)菜的生長(zhǎng)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，自然資源量已無法滿足社會(huì)需求，因此發(fā)菜的人工培養(yǎng)備受關(guān)注。本研究就培養(yǎng)條件及其對(duì)多糖等功能性物質(zhì)含量的影響進(jìn)行了測(cè)定分析，所得結(jié)論對(duì)發(fā)菜的人工培養(yǎng)及活性成分的開發(fā)利用都具有重要的指導(dǎo)意義。

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Effect of Nitrogen on the Growth and Polysaccharide Content of Nostoc flagelliforme

TANG Jun1,2，WAN Neng2，HU Zheng-yu1,*
(1.Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China；2. Department of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Cultivation of Nostoc flagelliforme in nitrogen-containing (BG11) and non-nitrogen-containing (BG110) media was conducted for figuring out the effects of nitrogen on the growth and the contents of phycobiliprotein (PC), allophycocyanin (APC), phycoerythrin (PE) and endo- and exopolysaccharides of Nostoc flagelliforme were investigated. The results showed that after 20 d cultivation, compared to BG110 medium, N. flagelliforme cultured in BG11 medium had much higher contents of Chl a, carotenoides, PE, APC and PC, but much lower contents of endo- and exo polysaccharides. The maximum content of endopolysaccharides was 1.03 mg/mL in BG110and 0.78 mg/mL in BG11, while that of exopolysaccharides was 243.8μg/mL in BG110 and 74.9μg/mL in BG11. These results indicate that nitrogen deficiency may inhibit the growth of N.flagelliforme, but promote the synthesis of endo- and exopolysaccharides to a certain extent.

Nostoc flagelliforme；nitrogen；polysaccharide；phycobiliprotein

TS254.58

A

1002-6630(2010)19-0092-04

2010-02-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30671611)；蘇州市科技局應(yīng)用藻類學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(SZS0806)

湯俊(1980—)，女，講師，博士，主要從事藻類生理生化研究。E-mail：tyilin929@hotmail.com

*通信作者：胡征宇(1957—)，男，研究員，博士，主要從事藻類生物技術(shù)和藻類系統(tǒng)分類學(xué)研究。E-mail：Huzy@ihb.ac.cn