江米酒脂肪酶對米酒奶脂肪水解風(fēng)味的影響

薛 璐，伍慧方，胡志和

江米酒脂肪酶對米酒奶脂肪水解風(fēng)味的影響

薛 璐，伍慧方，胡志和

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

利用傳統(tǒng)江米酒制備凝乳劑來制作米酒奶、其中江米酒脂肪酶活力為1.0～1.5LU/mL。通過酸度值(ADV)分析發(fā)現(xiàn)，脂肪酸的積累主要發(fā)生在凝乳期間。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測各游離脂肪酸的含量，棕櫚酸、油酸、豆蔻酸和硬脂酸占有較高的比例。

米酒奶；江米酒脂肪酶；脂肪水解

米酒奶，也稱中式傳統(tǒng)奶酪、宮廷奶酪、扣碗酪，是我國特有的傳統(tǒng)乳制品。它是由鮮牛奶和江米酒按一定比例混合，通過米酒中的酸性蛋白酶使牛奶凝固而成的。其外觀類似凝固型酸奶，具有牛奶和米酒的香味。目前米酒奶主要依靠手工制作，雖有少數(shù)關(guān)于米酒奶制作工藝與凝乳機(jī)理方面的研究[1-2]，但是對于其風(fēng)味方面的研究未見報道。

米酒奶的風(fēng)味不但來自于凝乳酶水解乳蛋白產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)，同時也受到江米酒中脂肪酶的影響。在前期實(shí)驗中[3]，對凝乳劑(江米酒)中提取的脂肪酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)米酒奶的凝乳和貯藏條件正適合于脂肪酶充分水解乳脂肪產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)。本研究在此基礎(chǔ)上，通過檢測米酒奶中游離脂肪酸的含量以及種類，確定江米酒脂肪酶對米酒奶風(fēng)味的影響程度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

江米、安琪甜酒曲、UHT乳、橄欖油 市售；氨丙基固相萃取小柱 美國Agilent公司；正壬酸(色譜純)、三羥甲基氨基甲烷 美國Sigma公司；25g/100mL四甲基氫氧化銨-甲醇溶液 比利時Acros Organics公司；鄰苯二甲酸氫鉀(工作基準(zhǔn)試劑)；其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SORVALL RC3BP低速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；CLIN-250生化培養(yǎng)箱 天津市華北實(shí)驗儀器有限公司；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；TRACE DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Finnigan公司。

1.3 方法

1.3.1 凝乳劑(江米酒)和米酒奶的制作

新鮮江米洗凈浸泡24h以上，常壓蒸20min，攤涼冷卻，加入體積分?jǐn)?shù)0.5%酒曲攪拌均勻，于30℃保溫發(fā)酵48h后，加水繼續(xù)發(fā)酵5d[4]，將發(fā)酵液于4℃、4000r/min離心20min，上清液即為米酒奶的凝乳劑。

將江米酒與牛奶按體積比1:9混合均勻后，在烤箱中80℃烤制40min[5]，取出晾涼后于4℃冰箱中后熟12h，即為米酒奶。

1.3.2 凝乳劑脂肪酶活力的檢測

采用堿性滴定法[6-7]，在測定條件下，每分鐘釋放1μmol脂肪酸的酶量定義為1個酶活力單位(LU)。

1.3.3 酸度值測定[8]

采用有機(jī)溶劑法。取20g樣品→加入飽和氯化鈉溶液25mL→加入乙醚正己烷混合萃取溶劑100mL(80:20，V/V)→4滴甲基橙指示劑→振蕩1min→加入體積分?jǐn)?shù)2%硫酸溶液至溶液pH2～3(粉紅色)→振蕩1min→1500r/min離心10min→取上清液→1-萘酚酞指示劑0.5mL→ 0.02mol/L氫氧化鉀-乙醇標(biāo)準(zhǔn)液滴定至溶液藍(lán)綠色

1.3.4 固相萃取米酒奶的游離脂肪酸[9-10]

取10g米酒奶，加入10mL無水乙醇，1mL 2.5mol/L鹽酸充分振蕩(加入正壬酸標(biāo)準(zhǔn)品)，然后加入15mL乙醚-正庚烷混合有機(jī)溶劑(1:1，V/V)，用漩渦振蕩器振蕩數(shù)秒。2500r/min離心3min后，上清液轉(zhuǎn)入裝有1g無水硫酸鈉的具塞三角瓶中，用10mL混合有機(jī)溶劑重復(fù)萃取兩次，合并脂肪萃取液。將萃取液過氨丙基固相萃取小柱(使用前先用10mL正庚烷清洗)，再用10mL氯仿-異丙醇混合洗液(2:1，V/V)將中性脂肪洗出，用5mL含有體積分?jǐn)?shù)2%甲酸的乙醚溶液過柱，獲得脂肪酸乙醚溶液。該溶液加入25g/100mL四甲基氫氧化銨-甲醇溶液，振蕩3min，靜置15min。用3mL乙醚沖洗兩次下層的脂肪酸鹽，再用2mol/L鹽酸-甲醇溶液中和至pH值為中性，得到待測樣進(jìn)行氣質(zhì)檢測。

1.3.5 游離脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)鑒定

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：TR-5MS石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；載氣為氦氣，流速1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度為275℃；升溫程序：40℃保持6min，以10℃/min升至140℃，再以4℃/min升至220℃，保持10min；進(jìn)樣量0.5μL；分流比20:1。

1.3.5.2 質(zhì)譜條件

離子源為EI；電子能量70eV；發(fā)射電流為100μA；傳輸線溫度250℃；離子源溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～350，溶劑延遲4min。

2 結(jié)果與分析

2.1 江米酒脂肪酶活力的大小

實(shí)驗中所用的酒曲是商品化的純種根霉曲，在發(fā)酵期間產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)闹久?。利用橄欖油為水解底物，將江米酒作為酶液直接檢測其脂肪酶活力，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)液態(tài)皺胃酶中的脂肪酶相當(dāng)，達(dá)到了1.0～1.5LU/mL，這為米酒奶在凝乳和貯藏期間游離脂肪酸的積累提供可能。2.2米酒奶貯藏期間酸度值的變化

米酒奶的脂肪水解程度就是酸度值(acid degree value，ADV)，表示游離脂肪酸的總量。取不同貯藏時間的樣品測定其酸度值，結(jié)果如圖1所示，其中，第0天是指凝乳前，第1天是指經(jīng)過12h后熟的產(chǎn)品。

圖1 米酒奶在貯藏期間酸度值的變化Fig.1 Change in acid degree value of Mijiunai during storage

由圖1可知，米酒奶在凝乳和貯藏期間ADV持續(xù)呈上升趨勢，制作過程變化較快，后期貯藏變化較緩慢。米酒奶在凝乳前的ADV為0.79μmol/g米酒奶，經(jīng)過40min的凝乳、晾涼以及12h的后熟，產(chǎn)生了大量的游離脂肪酸，增加到了1.79；在貯藏前中期，ADV緩慢增大，從1.79增加到了2.22；在貯藏后期，游離脂肪酸的積累速率有所加快。

在先前對江米酒脂肪酶酶學(xué)[3]的研究中發(fā)現(xiàn)：在米酒奶的制作過程中，凝乳溫度在45～50℃范圍內(nèi)，凝乳的中心溫度也接近45℃，而這正是江米酒脂肪酶的最適反應(yīng)溫度。在此溫度條件下，脂肪酶充分作用于牛奶中的乳脂肪，使脂肪水解生成大量的游離脂肪酸。

由于低溫貯藏條件，江米酒脂肪酶的活力受到了抑制，另外，米酒奶是以穩(wěn)定的酪蛋白凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形式存在的，作為分散相的脂肪球和脂肪酶接觸的幾率大大降低，因此，ADV在貯藏前中期比較穩(wěn)定。到貯藏后期，奶酪的凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生松散，有部分乳清析出和微生物的活動等，這些可能是ADV的增加又有所加快的原因。

2.3 米酒奶中的游離脂肪酸的種類及其變化

游離脂肪酸除了自身可以直接作為奶酪的風(fēng)味物質(zhì)，同時也是一些揮發(fā)性物質(zhì)的前體，有酮類、內(nèi)酯類、醇類、酯類以及醛類等[11]。

圖2是第14天米酒奶游離脂肪酸的總離子流圖。一共分離鑒定出10種脂肪酸，分別是丁酸(C4:0)、己酸(C6:0)、辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)、月桂酸(C12:0)、豆蔻酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)。結(jié)合圖3可以看出棕櫚酸、油酸、豆蔻酸和硬脂酸等脂肪酸占主要部分，占到了80%以上，這和牛乳的脂肪酸組成[12]是一致的。

圖2 第14天米酒奶游離脂肪酸的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of free fatty acids in Mijiunai on the 14thday of storage

圖3 米酒奶貯藏期間游離脂肪酸的變化Fig.3 Changes in free amino acids in Mijiunai after 13 days of storage

米酒奶在貯藏期間，中鏈脂肪酸(C10:0～C12:0)和長鏈脂肪酸 (C14:0～C18:2)相對于短鏈(C4:0～C8:0)而言變化較快，這和江米酒脂肪酶有密切關(guān)系。雖然根霉脂肪酶對乳脂肪的水解具有1,3位置專一性[13]；但是同時還對鏈長也有選擇性，其會優(yōu)先水解1,3位上有中長鏈脂肪酸的乳脂肪[14]。另外，短鏈脂肪酸的含量也有部分增加，這可能與UHT乳中殘存的嗜冷菌脂肪酶有關(guān)。

雖然短鏈脂肪酸占整個游離脂肪酸總量的比例較小，但是閾值很小，每一種都賦予米酒奶特有的風(fēng)味，例如，丁酸有腐臭味，己酸有刺激的辛辣味，辛酸有蠟味、體臭味，十二酸可以表現(xiàn)出桂花油味等。長鏈脂肪酸閾值相對較大，因此對米酒奶風(fēng)味的貢獻(xiàn)主要體現(xiàn)在口感上，隨著貯藏時間的延長，奶酪的酸味加重。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗中使用的凝乳劑(江米酒)的脂肪酶活力為1.0～1.5LU/mL。通過酸度值的測定，米酒奶在凝乳和后熟期間，游離脂肪酸總量從0.79μmol/g增加到了1.79μmol/g。利用GC-MS一共分離出10種游離脂肪酸，其中棕櫚酸、油酸、豆蔻酸和硬脂酸占了大部分。

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Effect of Lipase Contained in Glutinous Rice Wine on Lipolysis in Traditional Chinese-style Cheese

XUE Lu，WU Hui-fang，HU Zhi-he
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Milk coagulant prepared from glutinous rice wine was used to produce Mijiunai, also called traditional Chinese-style cheese. The lipolytic activity of glutinous rice wine used was between 1.0 LU/mL and 1.5 LU/mL. The accumulation of fatty acids happened mainly during milk-clotting period. The free fatty acid composition of Mijiunai was analyzed by GC-MS. Palmitic, oleic, myristic and stearic acids were found at higher concentrations.

Mijiunai；glutinous rice wine；lipase；lipolysis

TS201.25

A

1002-6630(2010)19-0071-03

2010-06-24

天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金項目(20070911)

薛璐(1976—)，女，副教授，博士，主要從事食品微生物研究。E-mail：hellenxue76@yahoo.com.cn