蝦蛋白過敏實(shí)驗(yàn)動物模型的建立

王麗娟，胡志和，陳照麗，周 汛，吳海明

蝦蛋白過敏實(shí)驗(yàn)動物模型的建立

王麗娟1,2，胡志和1,2，陳照麗2，周 汛2，吳海明2

(1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

以卵白蛋白為陽性對照，以平衡鹽溶液(PBS)為陰性對照，觀察蝦蛋白的全身過敏反應(yīng)。同時(shí)，觀察蝦蛋白對致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮反應(yīng)(Schultz-Dale反應(yīng))的影響，以建立蝦蛋白過敏實(shí)驗(yàn)動物模型。結(jié)果顯示，用0.01～2g/100mL卵白蛋白致敏并激發(fā)后，100%豚鼠呈全身過敏反應(yīng)陽性，0.1g/100mL卵白蛋白組的豚鼠100%死亡。相似質(zhì)量濃度蝦蛋白(0.01～1g/100mL)的全身過敏反應(yīng)與卵白蛋白相近(與卵白蛋白組比較，P＞0.05)；Schultz-Dale反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與全身過敏反應(yīng)結(jié)果相似。由此，初步建立蝦蛋白過敏實(shí)驗(yàn)的動物模型。

蝦蛋白；卵白蛋白；動物模型；全身過敏反應(yīng)；Schultz-Dale反應(yīng)

食物過敏是比較常見的一種食物不良反應(yīng)，也是醫(yī)學(xué)臨床上一種變態(tài)反應(yīng)。食物過敏發(fā)生率呈逐漸升高的趨勢[1-3]，越來越受到人們的重視。海產(chǎn)品作為人類一種重要的食物性蛋白質(zhì)的來源，深受人們的喜愛。然而，蝦與蟹等甲殼類動物及其制品又是引起食物過敏較常見的一類食品[4]。在開發(fā)這類食品之前，進(jìn)行過敏性研究并設(shè)法消除其中的過敏原或降低其過敏原性十分必要。因此，建立適當(dāng)?shù)氖澄镞^敏的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可以檢測食品中(如海蝦等甲殼類食品)過敏原的存在以及過敏原的致敏強(qiáng)度(即效價(jià))，是評價(jià)食品潛在致敏性最直接的方法。本研究以卵白蛋白為陽性對照，以平衡鹽溶液(PBS)為陰性對照，比較南美白對蝦蛋白質(zhì)(以下簡稱蝦蛋白)與卵白蛋白的全身過敏反應(yīng)；同時(shí)，觀察并比較南美蝦蛋白與卵白蛋白對豚鼠離體回腸平滑肌的致敏作用，初步建立蝦蛋白過敏實(shí)驗(yàn)的整體實(shí)驗(yàn)和離體器官實(shí)驗(yàn)的動物模型，為深入研究蝦蛋白過敏及進(jìn)一步評價(jià)南美蝦蛋白中過敏原的消減效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對蝦(活) 市售；卵白蛋白(純度≥90%，Ⅱ型) 美國Sigma公司；撲爾敏(批號0903006) 天津力生制藥股份有限公司；丙酮(分析純) 天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BL-420F生物信號采集系統(tǒng) 成都泰盟科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

英國種Hartly豚鼠，1～2月齡，體質(zhì)量170～250g，雌雄各半，由天津市實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為SCXK津2005-0001。

1.4 方法

1.4.1 南美白對蝦蛋白質(zhì)的制備

將南美白對蝦去殼去頭去尾去腸線后放在勻漿器中勻漿，然后加入4倍體積的冷丙酮(－20℃預(yù)冷過夜)，8000r/min離心15min，收集沉淀物并轉(zhuǎn)移至干凈的濾紙上，分散并讓其在室溫下空氣中風(fēng)干后粉碎，之后用抽提液(1mol/L KCl、0.5mmol/L DTT(1,4-dithiothreitol，pH7.4)按1:10(m/V)的比例抽提過夜，8000r/min離心15min，取上清。沉淀用抽提液繼續(xù)抽提4h，離心取上清。透析過夜，合并兩上清液后冷凍干燥，貯藏于－20℃的冰箱中備用。

1.4.2 全身過敏反應(yīng)

將合格動物隨機(jī)分為12組，其中包括陰性對照組(1組，PBS)、陽性對照組(2～7組，卵白蛋白)和蝦蛋白過敏原組(8～12組)。每組6只豚鼠，雌雄各半。在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周后進(jìn)行初次致敏，激發(fā)時(shí)靜脈(前肢皮下頭靜脈)注射不能一次成功者舍棄。

各組的致敏與激發(fā)方法見表1。致敏期間每天兩次觀察豚鼠的反應(yīng)，包括一般狀態(tài)、進(jìn)食、排泄物、有無過敏反應(yīng)表現(xiàn)等。激發(fā)后立即觀察60min內(nèi)動物的反應(yīng)[5]，統(tǒng)計(jì)各組動物的過敏反應(yīng)發(fā)生率及過敏反應(yīng)評分，建立蝦蛋白過敏原全身過敏性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動物模型。觀察指標(biāo)及過敏反應(yīng)評定標(biāo)準(zhǔn)[6]見表2。

表2 豚鼠過敏反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria of systemic allergic reaction assessment in guinea pig

1.4.3 致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮(Schultz-Dale反應(yīng))實(shí)驗(yàn)

將豚鼠隨機(jī)分成7組，每組4～5只。各組先用卵白蛋白等過敏原致敏，腹腔注射，1.0mL/(只·次)，隔日1次，共3次。末次注射后14d進(jìn)行腸平滑肌過敏原攻擊實(shí)驗(yàn)。取致敏豚鼠，放血處死，取出回腸一段，按離體器官裝置進(jìn)行安裝并描記，浴管內(nèi)均加入30mL臺氏液。待腸收縮曲線基線穩(wěn)定后，進(jìn)行過敏原攻擊，觀察并記錄腸收縮曲線，比較攻擊前后腸收縮力的變化，計(jì)算各鼠腸收縮變化率[7]，建立蝦蛋白過敏原豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

式中：F1為攻擊前的腸平滑肌收縮力/g；F2為攻擊后的腸平滑肌收縮力/g。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，通過方差分析和t檢驗(yàn)，比較各濃度卵白蛋白和蝦蛋白過敏反應(yīng)差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 全身過敏反應(yīng)結(jié)果

表1 全身過敏反應(yīng)致敏與激發(fā)方法Table 1 Sensitization and stimulation methods for general allergic reactions

表3 過敏反應(yīng)結(jié)果與評分Table 3 Results and scores for systemic allergic reactions

對卵白蛋白和南美蝦蛋白各組豚鼠分別進(jìn)行致敏和激發(fā)，在致敏和激發(fā)后密切觀察、記錄，并進(jìn)行評分。各組動物全身過敏反應(yīng)的評判結(jié)果見表3。

從表3可以看出，卵白蛋白和南美蝦蛋白各組均出現(xiàn)了明顯的過敏反應(yīng)，表現(xiàn)為Ⅰ型速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，嚴(yán)重者出現(xiàn)過敏性休克而死亡，其過敏反應(yīng)呈現(xiàn)一定的量-效關(guān)系，0.1g/100mL卵白蛋白和0.1g/100mL蝦蛋白呈100%極強(qiáng)陽性反應(yīng)。同質(zhì)量濃度的蝦蛋白與卵白蛋白比較，反應(yīng)極其相似。卵白蛋白的過敏原經(jīng)加熱不能消除，過敏反應(yīng)陽性率和死亡率均為100%；蝦蛋白加熱后(過濾)，過敏反應(yīng)發(fā)生率為100%，而嚴(yán)重程度有所減弱，可能與加熱過濾后溶液中的過敏原濃度降低有關(guān)。

表4 卵白蛋白、蝦蛋白的致敏作用比較(加入量0.2mL)Table 4 Comparison of sensitization between egg-white protein and shrimp protein

2.2 致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮實(shí)驗(yàn)

2.2.1 卵白蛋白對豚鼠離體回腸平滑肌的致敏作用

采用2g/100mL和0.1g/100mL卵白蛋白過敏原致敏豚鼠。攻擊時(shí)加入過敏原0.2mL，可見0.1g/100mL卵白蛋白使腸平滑肌的收縮力較攻擊前明顯加強(qiáng)(P＜0.01)；2g/100mL卵白蛋白也使腸平滑肌的收縮力較攻擊前加強(qiáng)，但與攻擊前比較，差異不顯著(P＞0.05)，這可能是由于過敏原致敏所用劑量較大，導(dǎo)致在強(qiáng)化致敏期間有部分過敏活性物質(zhì)釋放，引起腸平滑肌的張力增高，使其在過敏原攻擊后的收縮力變化不甚明顯。兩質(zhì)量濃度卵白蛋白的腸收縮力改變率差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果見表4中1組和2組。

2.2.2 蝦蛋白對豚鼠離體回腸平滑肌的致敏作用

用2g/100mL和0.1g/100mL南美蝦蛋白致敏豚鼠，再用相應(yīng)的致敏原攻擊腸平滑肌，結(jié)果見表4中的3組和4組。當(dāng)致敏后的腸平滑肌受到0.1g/100mL蝦蛋白攻擊后，腸平滑肌的收縮力也明顯加強(qiáng)(P＜0.01)，反應(yīng)與卵白蛋白相似(P＞0.05)，說明蝦蛋白具有很強(qiáng)的致敏性，而2g/100mL的蝦蛋白對致敏腸平滑肌的攻擊作用則不明顯(P＞0.05)，可能與致敏時(shí)所用劑量較大有關(guān)。不同質(zhì)量濃度的蝦蛋白間收縮力改變率差異不顯著(P＞0.05)。

2.2.3 撲爾敏對卵白蛋白和蝦蛋白致敏作用的影響

據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道，撲爾敏0.06μg/mL可完全阻斷組胺的腸平滑肌收縮作用。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，選用0.16μg/mL和0.32μg/mL兩種質(zhì)量濃度，即待腸管活動穩(wěn)定后，先加入撲爾敏，待作用明顯并穩(wěn)定后，再加入卵白蛋白進(jìn)行攻擊，觀察腸管收縮活動的變化。結(jié)果表明0.16μg/mL的撲爾敏即有明顯的阻斷作用。故選用撲爾敏的質(zhì)量濃度0.16μg/mL用于以下實(shí)驗(yàn)中。

表5 撲爾敏對卵白蛋白和南美蝦蛋白過敏原致敏作用的影響Table 5 Blocking effect of chlorphenamine on the sensitization of egg-white protein and shrimp protein

首先給予撲爾敏(0.16μg/mL)，待作用穩(wěn)定后再給予與前相同劑量的過敏原，通過比較給予撲爾敏前后腸管活動的不同，分析腸平滑肌的過敏反應(yīng)與組胺釋放的關(guān)系，結(jié)果見表5。

從表5可以看出，事先加入撲爾敏，再用卵白蛋白或蝦蛋白攻擊其致敏的腸平滑肌，腸平滑肌的收縮力明顯降低(與攻擊前比較，均P＞0.05)，收縮力的改變率較未經(jīng)撲爾敏處理時(shí)(表4)明顯減小，表明撲爾敏可阻斷卵白蛋白和蝦蛋白致敏腸平滑肌的收縮活動，提示組胺的釋放對致敏腸平滑肌的收縮活動起重要作用。撲爾敏對蝦蛋白與卵白蛋白的作用無明顯差別(均P＞0.05)。

3 討 論

食物過敏是一種變態(tài)反應(yīng)，它與藥物過敏在發(fā)生過程、發(fā)生機(jī)制及過敏表現(xiàn)等方面很相似。食物過敏的發(fā)生與否與個體的體質(zhì)、免疫狀態(tài)、食物的特點(diǎn)等有關(guān)。過敏體質(zhì)者接觸少量的過敏原便可致敏，當(dāng)再次接觸過敏原，機(jī)體可發(fā)生過敏反應(yīng)。食物過敏可以累及全身許多臟器，如口腔、消化道、呼吸道、皮膚、心血管等，引起各種臨床表現(xiàn)[8]。食物是要進(jìn)入機(jī)體并發(fā)揮作用的，一般的體外實(shí)驗(yàn)很難模擬機(jī)體復(fù)雜的過敏反應(yīng)發(fā)生過程。所以，設(shè)計(jì)和建立適當(dāng)?shù)倪^敏反應(yīng)動物模型是進(jìn)行食物過敏安全性評價(jià)和發(fā)生機(jī)制研究的必要手段。

理想的過敏動物模型，應(yīng)具有與人類食物過敏相同的發(fā)生機(jī)制，過敏發(fā)生率足夠高，出現(xiàn)的過敏反應(yīng)癥狀與人類相似，并能保證足夠的實(shí)驗(yàn)動物。過敏實(shí)驗(yàn)的動物可以采用豚鼠、大鼠、小鼠、家兔等。豚鼠具有易感性，其發(fā)生的過敏反應(yīng)與人類的反應(yīng)及其相似，是最普遍使用的比較理想的藥物和食物過敏模型動物之一[7,9]。BN大鼠制作食物過敏的動物模型也比較理想[10]。

目前，關(guān)于食物過敏的動物模型尚不成熟，國際上尚未建立食物致敏原評估的標(biāo)準(zhǔn)動物模型，有關(guān)蝦蛋白過敏的動物模型報(bào)道甚少。卵白蛋白是過敏實(shí)驗(yàn)常用的陽性對照品，該實(shí)驗(yàn)選用豚鼠為實(shí)驗(yàn)對象，以PBS溶液為陰性對照，以卵白蛋白為陽性對照，觀察并比較了南美蝦蛋白與卵白蛋白的全身過敏反應(yīng)；同時(shí)，以致敏的豚鼠離體回腸為標(biāo)本，觀察并比較了南美蝦蛋白與卵白蛋白對致敏回腸平滑肌收縮作用的影響。以此初步建立蝦過敏的整體實(shí)驗(yàn)和離體器官實(shí)驗(yàn)的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

結(jié)果顯示，相同劑量的蝦蛋白和卵白蛋白的全身過敏反應(yīng)極其相似，表明蝦蛋白過敏原效價(jià)與卵白蛋白相近，且過敏反應(yīng)發(fā)生呈現(xiàn)出劑量-效關(guān)系，即增加過敏原的劑量，出現(xiàn)過敏反應(yīng)的動物數(shù)增加，過敏反應(yīng)程度加重；降低劑量到一定水平，陽性率也大大降低，與藥物過敏反應(yīng)的發(fā)生比較一致[11]。Schultz-Dale反應(yīng)實(shí)驗(yàn)是觀察和評價(jià)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)常用的方法，方法簡便、易行。致敏動物的腸平滑肌在抗原攻擊時(shí)釋放過敏介質(zhì)(如組胺)，使平滑肌收縮。通過觀察并比較抗原攻擊后腸平滑肌的收縮程度，分析過敏原的致敏性[7]。蝦蛋白與卵白蛋白的Schultz-Dale反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與全身過敏反應(yīng)結(jié)果性質(zhì)相似。

綜上結(jié)果可以看出，以卵白蛋白為對照建立的蝦蛋白過敏實(shí)驗(yàn)的動物模型是可靠的。將全身過敏反應(yīng)(整體實(shí)驗(yàn))模型與致敏豚鼠回腸平滑肌收縮(離體器官)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)合，用于檢驗(yàn)和評價(jià)食品的過敏反應(yīng)，尤其是評價(jià)海蝦類食品的過敏反應(yīng)及過敏原的消減效果，方法簡便，結(jié)果可靠。結(jié)合體外檢測結(jié)果，檢驗(yàn)和評價(jià)食品過敏原的消減效果，結(jié)論將更加可靠。

一般來說，食物過敏反應(yīng)是一種由IgE介導(dǎo)的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)[12]。該實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了蝦蛋白過敏與組胺的釋放有關(guān)。若能檢測該模型過敏動物致敏過程中和激發(fā)后血清IgE和IgG的水平[13-14]，檢測激發(fā)后血清及局部組織過敏性活性物質(zhì)的含量，以及進(jìn)行動物被動皮膚過敏檢測[15]等，則可以進(jìn)一步綜合評價(jià)該模型的可靠性，本課題組將深入研究。

[1]HUNSON L, TELEMO E. The growing allergy problerm[J]. Acta Pediatr, 1997, 86(9): 916-918.

[2]KAY A B. Allergy and allergic diseases. First of two parts[J]. N Engl J Med, 2001, 344(1): 30-37.

[3]KAY A B. Allergy and allergic diseases. Second of two parts[J]. N Engl J Med, 2001, 344(2): 109-113.

[4]DEAN D M, HUGH A S, RONALD A S. Food Allergy: Adverse reactions to foods and food additives[M]. 2nd ed. USA Blackwell Science Inc, 1997.

[5]徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 2版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1991: 1200.

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn). 中藥成方制劑: 第十七冊[S]. 1998: 170; 200.

[7]徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 3版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2003: 1411-1412; 237-238.

[8]BISCHOFF S, CROWE S S. Gastrointestinal food allergy: New insights into pathophysiology and clinical perspectives[J]. Gastroenterology, 2005, 128(4): 1089-1113.

[9]金亞宏, 曹秀芳, 李蘭芳, 等. 茵陳五芩散抗變態(tài)反應(yīng)作用研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 1999, 5(2): 49-50.

[10]呂相征, 劉秀梅, 楊曉光. BN大鼠食物過敏動物模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志, 2005, 17(2): 103-105.

[11]周立國. 藥物毒理學(xué)[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2003: 188.

[12]藍(lán)程, 唐承薇. 食物過敏疾病的免疫發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué): 內(nèi)科學(xué)分冊, 2001, 28(10): 433-435.

[13]LIN X P, MAGNUSSON J, AHLSTEDT S, et al. Local allergic reaction in food-hypersensitive adults despite a lack of systemic food-hypersensitive IgE[J]. J Allergy Clin Immunol, 2002, 109(5): 879-887.

[14]COEFFIER M, LORENTZ A, MANNS M P, et al. Epsilon germ-line ang IL-4 transcripts are expressed in human intestinal mucosa and enhanced in patients with food allergy[J]. Allergy, 2005, 60(6): 822-827.

[15]XIANG Z, MOLLER C, NILSSON G. Readministration of IgE is required for repeated passive cutaneous anaphylaxis in mice[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2006, 141(2): 168-171.

Establishment of an Animal Model for Shrimp Protein Sensitivity Test

WANG Li-juan1,2，HU Zhi-he1,2，CHEN Zhao-li2，ZHOU Xun2，WU Hai-ming2
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, Tianjin 300134, China；2. College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Egg albumin was used as the positive control and balanced salt solution (PBS) was used as the negative control to observe general allergic reactions of shrimp protein. Guinea pig was used to establish an animal model for shrimp protein sensitivity test by observing the effect of shrimp protein on isolated ileal smooth muscle contraction reaction (Schultz-Dale reaction). Results indicated that the general allergic reactions in each guinea pig were positive after stimulated by egg albumin at a concentration varying from 0.01 to 1 g/100mL. All the guinea pigs died after the stimulation with egg albumin at a concentration of 0.1 g/100mL. The general allergic reactions of shrimp protein were similar with those of egg albumin at the similar concentration range from 0.01 to 1 g/100mL. Meanwhile, the Schultz-Dale reaction results were also similar with those of systemic allergic reactions. Therefore, an animal model for shrimp protein sensitivity test has been successfully established.

shrimp protein；egg albumin；animal model；systemic allergic reaction；Schultz-Dale reaction

TS201.6；R151.41

A

1002-6630(2010)19-0347-04

2010-06-21

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(2008BAD94B09)

王麗娟(1961—)，女，教授，碩士，主要從事食品毒理學(xué)研究。E-mail：wljuan@tjcu.edu.cn