副干酪乳桿菌對(duì)甘薯漿液中淀粉絮凝機(jī)理研究

李新華，趙曉陽(yáng)，張荔力

副干酪乳桿菌對(duì)甘薯漿液中淀粉絮凝機(jī)理研究

李新華1，趙曉陽(yáng)1，張荔力2

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2.遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

為探討酸漿法分離甘薯淀粉傳統(tǒng)工藝中的淀粉沉降分離機(jī)理，進(jìn)一步制備高效生物絮凝劑。本實(shí)驗(yàn)采用Zeta電位測(cè)定、粒度分析及離子鍵檢測(cè)研究副干酪乳桿菌對(duì)甘薯淀粉絮凝沉淀的作用。結(jié)果表明：絮凝過程基于“架橋”機(jī)理，淀粉顆粒與菌體間靠離子鍵結(jié)合，絮凝作用使懸濁液中淀粉平均粒徑減小，密度增大，導(dǎo)致淀粉顆粒凝聚沉降；通過熱處理和酶處理實(shí)驗(yàn)分析菌體起絮凝作用的活性成分組成，表明副干酪乳桿菌活性成分為蛋白類物質(zhì)。

副干酪乳桿菌；甘薯淀粉；絮凝機(jī)理

絮凝作用是用以沉淀分離混合乳液中淀粉、蛋白質(zhì)以及污水治理中提取分離有機(jī)物的主要方法[1]。微生物絮凝劑(microbial flocculant，MBF)是由微生物產(chǎn)生的一類具有一定絮凝活性的生物高分子化合物。與傳統(tǒng)化學(xué)絮凝劑鋁鹽、鐵鹽和聚丙烯酞胺相比，它具有高效、無(wú)毒、無(wú)二次污染的優(yōu)點(diǎn)，是化學(xué)絮凝劑理想的替代產(chǎn)品[2-3]。絮凝機(jī)理的研究對(duì)微生物絮凝劑的開發(fā)應(yīng)用有著重要的意義，在機(jī)理的研究中已取得重要進(jìn)展，提出了如Butterfield黏質(zhì)假說、吸附架橋和電中和作用等學(xué)說[4-5]，而傳統(tǒng)酸漿法沉降分離甘薯淀粉的機(jī)理尚未明確。本實(shí)驗(yàn)對(duì)甘薯淀粉中副干酪乳桿菌絮凝機(jī)理進(jìn)行深入的研究，揭示其對(duì)淀粉高效絮凝活性的原因，為進(jìn)一步在甘薯淀粉生產(chǎn)中應(yīng)用，改變甘薯淀粉傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝，提高甘薯淀粉質(zhì)量及產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及試劑

副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)由遼寧醫(yī)學(xué)院食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，本實(shí)驗(yàn)室保存。

胰蛋白酶 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；α-淀粉酶北京奧博星生物技術(shù)有限公司；EDTA、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、尿素 沈陽(yáng)沈一精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 甘薯漿液體培養(yǎng)基

酵母粉5g、乳糖5g、K2HPO42g、吐溫-80 1mL、甘薯漿1000mL，調(diào)pH6.2～6.4，121℃高壓蒸汽滅菌30min。

1.3 儀器與設(shè)備

Nano-ZS型Zeta電位分析儀 英國(guó)Malvern公司；Microtrac S3500激光衍射式粒度分布測(cè)定儀 美國(guó)麥奇克公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CR-21G高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；Sartorius標(biāo)準(zhǔn)型PB-10 pH計(jì) 上海摩速科學(xué)器材有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 副干酪乳桿菌發(fā)酵液的制備

取菌種按體積分?jǐn)?shù)1%接種于甘薯漿液體培養(yǎng)基中，置25℃靜置培養(yǎng)48h，保存待用。

1.4.2 絮凝活性測(cè)定

將鮮甘薯與水按1:4(m/V)比例在組織搗碎機(jī)中打碎10min，80目篩子過濾。取濾液100mL加入10mL發(fā)酵液，混合攪拌使之充分混合，靜置5min后于550nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A1)，以空白培養(yǎng)基代替發(fā)酵液作對(duì)照實(shí)驗(yàn)，550nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A2)。絮凝活性(以絮凝率表示)按式(1)計(jì)算。

1.4.3 副干酪乳桿菌發(fā)酵液絮凝活性的分布實(shí)驗(yàn)

取10mL發(fā)酵液，5000r/min離心20min，留上清液備用。沉淀物用蒸餾水洗滌兩次后，加入10mL蒸餾水制成懸濁液，分別測(cè)定發(fā)酵原液、上清液以及沉淀物懸濁液的絮凝活性。

1.4.4 絮凝過程Zeta(ζ)電位的測(cè)定

1.4.4.1 pH值對(duì)Zeta電位的影響

稱取100mL的甘薯淀粉，其中加入10mL發(fā)酵液，將pH值調(diào)節(jié)到4.0～6.0，搖勻，靜置一段時(shí)間后，測(cè)定絮凝前后淀粉乳的ζ電位。

1.4.4.2 鹽溶液對(duì)Zeta電位的影響

稱取100mL的甘薯淀粉，其中加入10mL發(fā)酵液，將pH值調(diào)至4.5，添加質(zhì)量濃度為1g/100mL的不同種類的鹽溶液和10mL發(fā)酵液，搖勻，靜置一段時(shí)間后，測(cè)定絮凝前后淀粉乳的ζ電位。

1.4.5 絮凝前后淀粉顆粒粒度的變化

將最佳條件下絮凝后靜置10min的淀粉乳上清液、沉淀以及原淀粉乳溶液，通過Microtrac S3500激光衍射式粒度分布測(cè)定儀，測(cè)定淀粉絮凝前后顆粒粒度分布變化。

1.4.6 菌體與淀粉顆粒之間結(jié)合鍵的檢測(cè)

分別用2mol/L EDTA、3mol/L HCl溶液和5mol/L尿素處理絮凝沉淀，輕輕搖勻，靜置一段時(shí)間后觀察現(xiàn)象。

1.4.7 副干酪乳桿菌絮凝活性物質(zhì)成分的初步測(cè)定

1.4.7.1 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將副干酪乳桿菌發(fā)酵液分別在30、40、50、60、70、80、90℃水浴中加熱30min，然后分別測(cè)定加熱后的發(fā)酵液對(duì)淀粉乳的絮凝率。

1.4.7.2 酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

用250mmol/L EDTA及蒸餾水各洗兩次菌體，洗過的菌體細(xì)胞重新懸于分別加有蛋白酶、糖化酶的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液中，30℃保溫，在不同時(shí)間取樣，測(cè)定絮凝水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同絮凝劑對(duì)甘薯淀粉絮凝活性的比較

通過對(duì)絮凝率的檢測(cè)，得知發(fā)酵原液、上清液以及沉淀物懸濁液的絮凝率分別為72.30%、23.41%、72.37%。沉淀物懸濁液的絮凝率很高，而上清液絮凝的效果較差，表明絮凝活性物質(zhì)主要存在于菌體中，而不是菌體細(xì)胞的胞外代謝產(chǎn)物。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中以菌體為對(duì)象，分析其絮凝機(jī)理。

2.2 絮凝過程Zeta電位的測(cè)定

2.2.1 pH值對(duì)ζ電位的影響

圖1 pH值對(duì)Zeta電位的影響Fig.1 Effect of pH value on Zeta potential

經(jīng)測(cè)定，絮凝前淀粉顆粒ζ電位是－13.7mV，菌體ζ電位是－0.49mV。由圖1可見，菌體絮凝沉淀淀粉，當(dāng)pH值為4.0時(shí)，淀粉乳ζ電位最低(絕對(duì)值)，為－2.29mV，隨著pH值的升高，ζ電位(絕對(duì)值)逐漸增大。pH值為5.0～6.0時(shí)，體系ζ電位(絕對(duì)值)較高，相應(yīng)分散穩(wěn)定性好。

2.2.2 鹽溶液對(duì)ζ電位的影響

當(dāng)分別加入1g/100mL的NaCl、KCl、CaCl23種鹽溶液，pH值為4.5時(shí)，絮凝后淀粉顆粒電位分別為－2.47、－8.19、－10.40。當(dāng)Na+與絮凝劑共同作用時(shí)，ζ電位(絕對(duì)值)小于pH4.5不加鹽溶液的淀粉乳ζ電位，對(duì)淀粉顆粒的絮凝能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)使用絮凝劑，由此說明Na+起到助凝劑的作用。

淀粉顆粒與菌體在水中都帶負(fù)電，它們之間存在較大的靜電斥力。要克服菌體與淀粉顆粒之間的靜電排斥力，就一定存在某種特殊的作用力。數(shù)值顯示，當(dāng)?shù)矸垲w粒表面電位降低到一定低點(diǎn)時(shí)，此淀粉顆粒的穩(wěn)定性降到某個(gè)程度，顆粒將很快聚沉。因此，在絮凝過程中，每個(gè)菌體可以和多個(gè)淀粉顆粒結(jié)合，這樣便形成了“架橋”作用，從而形成大顆粒迅速沉降下來(lái)。而在同一pH值下，ζ電位隨著Na+的添加，向零電點(diǎn)處靠近，這說明Na+所帶正電荷與淀粉顆粒表面所帶負(fù)電荷發(fā)生了電中和作用。由此得出，Na+的加入導(dǎo)致電中和作用壓縮雙電層，使菌體對(duì)淀粉顆粒的吸附凝聚量增加。

2.3 絮凝前后淀粉顆粒粒度的變化

圖2 絮凝前后淀粉顆粒粒度的變化Fig.2 Change in starch granular size before and after flocculation

為考察發(fā)酵液作用后淀粉粒徑變化情況，經(jīng)粒度分析儀測(cè)定得到的結(jié)果見圖2。經(jīng)發(fā)酵液處理前后，甘薯淀粉溶液中顆粒粒徑分布發(fā)生明顯變化，處理后的甘薯漿液中的淀粉顆粒粒徑變小。說明經(jīng)發(fā)酵液處理，淀粉顆粒被菌體吸附，由于淀粉顆粒自身的雙電層在吸附過程中被破壞，使得粒徑變小，顆粒密度增大，同時(shí)淀粉顆粒間產(chǎn)生“架橋”現(xiàn)象，形成較大的絮凝體并由重力作用在漿液中迅速下沉。該結(jié)果直觀上顯示了發(fā)酵液的作用機(jī)理為菌體與淀粉顆粒間的吸附和“架橋”作用。

2.4 菌體與淀粉顆粒之間結(jié)合鍵的檢測(cè)

加入EDTA和HCl的絮凝沉淀中絮塊大量分解，加入尿素的絮凝沉淀無(wú)明顯的解絮現(xiàn)象。由此現(xiàn)象可知，絮凝沉淀對(duì)EDTA和HCl敏感，而對(duì)尿素不敏感，因?yàn)镋DTA和HCl能與淀粉顆粒結(jié)合，破壞離子鍵，從而發(fā)生解絮現(xiàn)象。而尿素和淀粉顆粒之間可形成氫鍵。因此可以推測(cè)絮凝劑與甘薯淀粉之間的結(jié)合可能是靠離子鍵結(jié)合的。

2.5 絮凝活性物質(zhì)成分測(cè)定

據(jù)資料[6-7]報(bào)道，菌體絮凝作用的主要活性成分可能是蛋白質(zhì)類或糖類物質(zhì)。為了分析副干酪乳桿菌主要起絮凝作用的活性成分，本研究進(jìn)行酶解和熱作用實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步了解絮凝作用機(jī)理。

2.5.1 絮凝活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

圖3 溫度對(duì)絮凝活性物質(zhì)的影響Fig.3 Effect of temperature on flocculating activity

某些由多糖構(gòu)成的絮凝劑基本不受溫度的影響[8-9]，而以蛋白質(zhì)為主要成分的微生物絮凝劑的活性受溫度影響很大，高溫時(shí)變性，喪失部分絮凝能力[10]。由圖3可知，其絮凝率隨著溫度的升高而迅速降低。在50℃以后，副干酪乳桿菌發(fā)酵液幾乎沒有絮凝活性。說明絮凝活性物質(zhì)不具有熱穩(wěn)定性，絮凝活性受溫度的影響較大。這一結(jié)果也進(jìn)一步說明該絮凝活性物質(zhì)的絮凝作用是由菌體細(xì)胞本身產(chǎn)生的，它的主要有效成分是蛋白類物質(zhì)。

2.5.2 絮凝活性物質(zhì)的酶穩(wěn)定性

由圖4可知，在胰蛋白酶催化水解作用下，絮凝活性物質(zhì)的絮凝水平迅速下降，在20min時(shí)，絮凝活性降低到低于10%。因此，該絮凝活性物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶的作用是敏感的，在胰蛋白酶的作用下其絮凝活性顯著下降，這是因?yàn)樾跄钚晕镔|(zhì)在酶的作用下水解，從而引起多聚物分子質(zhì)量降低。證明該絮凝活性物質(zhì)絮凝作用主要來(lái)自蛋白質(zhì)。而α-淀粉酶對(duì)絮凝活性影響較小，糖類不起主要絮凝作用。

圖4 酶對(duì)絮凝活性物質(zhì)的影響Fig.4 Effect of enzyme on flocculating activity

3 結(jié) 論

副干酪乳桿菌發(fā)酵液在甘薯漿液中對(duì)淀粉具有明顯的絮凝活性，實(shí)驗(yàn)證明起絮凝作用活性物質(zhì)主要存在于菌體中，而不是菌體細(xì)胞的胞外代謝產(chǎn)物。甘薯漿液中的淀粉顆粒在絮凝后粒徑變小，顆粒密度增大，菌體大分子通過離子鍵作用與多個(gè)淀粉顆粒結(jié)合，并在淀粉顆粒間產(chǎn)生“架橋”現(xiàn)象，形成較大的淀粉絮凝體沉淀下來(lái)，同時(shí)Na+作為助凝劑起到電中和作用。絮凝活性物質(zhì)的主要有效成分是蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

本研究雖然初步證明絮凝活性成分是蛋白質(zhì)類物質(zhì)，但這類物質(zhì)究竟出于哪種蛋白，是簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)還是復(fù)合蛋白質(zhì)，在菌體上是如何分布的，以及從菌體上分離出來(lái)還能否具有絮凝活性，都還有待于進(jìn)一步研究。副干酪乳桿菌對(duì)于其他成分的絮凝作用如何，能否在污水治理等過程中作為生物絮凝劑，也有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

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Flocculation Mechanism of Sweet Potato Starch by Addition of Lactobacillus paracasei-fermented Sweet Potato Slurry

LI Xin-hua1，ZHAO Xiao-yang1，ZHANG Li-li2
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China；2. College of Food Science and Engineering, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

The goal of this work was to explore the mechanism of sedimentation separation of starch by acidic steeping liquor method so as to provide experimental guidance for the development of highly efficient bioflocculant. The Lactobacillus paracasei-fermented sweet potato slurry and its centrifugation supernatant and resuspended precipitate were separately added with sweet potato starch, and the flocculation of sweet potato starch in the three liquors was studied by the determination of Zeta potential, granular size and ionic bond. The flocculation of sweet potato starch was based on the bridging mechanism, and starch granules were conjugated with bacterial cells through ionic bond, and after flocculation, mean starch granular size decreased and granular density increased, resulting in the aggregation and sedimentation of starch granules. Moreover, from the results of experiments on the thermal and enzymatic stability of substances with flocculating activity, proteins were the active components in Lactobacillus paracasei responsible for flocculation.

Lactobacillus paracasei；sweet potato starch；bridging mechanism

TS201.3

A

1002-6630(2010)19-0273-04

2010-01-22

李新華(1955—)，男，教授，碩士，主要從事糧油深加工與轉(zhuǎn)化研究。E-mail：lixh.syau@163.com