響應(yīng)面法優(yōu)化離子交換法固定化β-D-呋喃果糖苷酶

張媛媛，聶少平，萬 成，謝明勇*

響應(yīng)面法優(yōu)化離子交換法固定化β-D-呋喃果糖苷酶

張媛媛，聶少平，萬 成，謝明勇*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

以大孔陰離子樹脂D311為載體，對日本曲霉來源的β-D-呋喃果糖苷酶進(jìn)行離子交換法固定化。研究溫度、pH值、時(shí)間、游離酶液酶活力對固定化效果的影響，并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面法對固定化條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳固定化條件為：室溫、pH6.6、固定化時(shí)間4h、游離酶液酶活力為900U/mL，在此條件下，固定化β-D-呋喃果糖苷酶生產(chǎn)的低聚果糖產(chǎn)量可達(dá)58.16%。

β-D-呋喃果糖苷酶；離子交換法；固定化；響應(yīng)面法

低聚果糖(fructooligosacchrides，F(xiàn)OS)又名蔗果低聚糖具有良好的生理功能[1-2]，特別對改善人體內(nèi)微生物環(huán)境有很大幫助，使人體內(nèi)有益菌群——雙歧桿菌數(shù)量增多，同時(shí)抑制有害菌的生長、改善腸道環(huán)境、防止便秘[3-5]；除此之外還具有降低血脂和膽固醇、預(yù)防齲齒、提高機(jī)體免疫力等重要功能。

工業(yè)上，主要以蔗糖作底物用微生物酶法生產(chǎn)低聚果糖。一般認(rèn)為生產(chǎn)低聚果糖是通過β-D-呋喃果糖苷酶催化蔗糖水解并將果糖基轉(zhuǎn)移到蔗糖分子的果糖殘基位置上而合成的。由于游離酶在工業(yè)生產(chǎn)中反應(yīng)條件較難控制，容易流失，而固定化酶與其相比具有貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點(diǎn)[6-7]。樹脂價(jià)格低廉，物化性能穩(wěn)定，易再生，作為固定化載體有著廣闊的應(yīng)用前景，并有較為成功的范例[8-9]。離子交換樹脂是一類不溶且具有三維空間網(wǎng)狀骨架結(jié)構(gòu)的親水性功能高分子。連接在樹脂骨架上的功能基，可通過吸附、共價(jià)鍵、離子鍵、配位鍵、微膠囊等形式及其他手段將酶固定在樹脂上，構(gòu)成固定化酶[10]。離子交換法生產(chǎn)的固定化酶具有機(jī)械強(qiáng)度高，性質(zhì)穩(wěn)定，可以反復(fù)再生使用，工作壽命長等優(yōu)點(diǎn)。

本研究以大孔陰離子樹脂D311為載體，對日本曲霉(Aspergillus japonicus)來源的β-D-呋喃果糖苷酶進(jìn)行固定化，并采用響應(yīng)面法對固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為低聚果糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓊脂、酵母膏 市售。

蔗糖(Suc，分析純)、NaNO3、K2HPO4、(NH4)SO4、MgSO4·7H2O、乙腈(色譜純) 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；樹脂D311 蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司；低聚果糖標(biāo)品：蔗果三糖(GF2，純度99.8%)、蔗果四糖(GF3，純度99.8%)、蔗果五糖(GF4，純度86.7%)日本和光純藥工業(yè)株式會社。

1.2 儀器與設(shè)備

ELSD-UM 3000高效液相色譜儀-蒸發(fā)光散射檢測器上海通微科技有限公司；XWK-3A空氣泵 天津市華生分析儀器廠；KQ2200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司；SB-2000水浴鍋 上海愛郎儀器有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；FA1104電子天平 上海精天電子儀器廠。

1.3 菌種與培養(yǎng)基

日本曲霉，實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

查氏培養(yǎng)基：蔗糖30g、瓊脂15g、NaNO33g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g，水1000mL，pH6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50g、酵母膏35g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O 1g、(NH4)2SO43g，水1000mL，pH6.0。

1.4 方法

1.4.1 β-D-呋喃果糖苷酶游離酶液的制備

取適量日本曲霉菌體，用無菌水配成菌懸液，精確量取3mL菌懸液加入到液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)48h，搖床轉(zhuǎn)速120r/min。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液進(jìn)行細(xì)胞破碎，4℃、8000r/min離心10min，取上清液，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 離子交換樹脂的預(yù)處理

離子交換樹脂先用蒸餾水浸泡脹潤，去雜，然后用4g/100mL NaOH和1.3mol/L HCl溶液交替在磁力攪拌器下攪拌浸泡10h，并分別用蒸餾水沖洗至中性，最后用兩倍體積以上蒸餾水浸泡于4℃冰箱中保存?zhèn)溆肹11]。

1.4.3 固定化β-D-呋喃果糖苷酶

以大孔陰離子樹脂D311為固定化載體，取5g處理好的樹脂，放入250mL錐形瓶中，加入25mL游離酶液，放入搖床中，在室溫下，以120r/min的轉(zhuǎn)速振蕩5h，取出后靜置1h，抽干，用蒸餾水洗滌，直至洗出液中無酶活，即可得到固定化β-D-呋喃果糖苷酶，備用。

1.4.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12-15]

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對固定化結(jié)果影響較大的3個(gè)因素，以低聚果糖產(chǎn)量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，因素及水平設(shè)計(jì)見表1。根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可以分為兩類，其一是析因點(diǎn)，自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12個(gè)析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

1.4.5 低聚果糖的生產(chǎn)及其測定方法

表1 β-D-呋喃果糖苷酶的固定化條件優(yōu)化設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels in the response surface design

將適量制備的固定化酶加入到用檸檬酸緩沖液(0.1mol/L，pH5.4)配制的50g/100mL蔗糖溶液中，50℃反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后，煮沸5min，8000r/min離心10min，將上清液過0.45μm濾膜，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測法對低聚果糖進(jìn)行檢測，檢測條件為：色譜柱：Waters NH2分析柱(4.6mm×300mm，5μm)，流動相：乙腈(A)、水(B)，梯度洗脫[16]；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10μL；ELSD的漂移管溫度：85℃；載氣：空氣流速2.0L/min。

1.4.6 固定化酶固定化效果測定

采用低聚果糖產(chǎn)率作為衡量固定化酶固定化的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對固定化效果的影響

在pH5.0～7.0、溫度25℃、固定化時(shí)間5h、游離酶酶活力800U/mL的條件下，考察pH值對固定化酶固定化效果的影響。結(jié)果見圖1。

一般來講，溶液的pH值決定著樹脂交換基團(tuán)及交換離子的解離程度，它不但影響樹脂的交換容量，而且對交換的選擇性也有很大影響。D311作為弱堿性樹脂，溶液pH值越低，其交換能力越高，所以應(yīng)在pH≤7.0的溶液中使用，但是對于生物活性分子來說，過強(qiáng)的吸附會增加酶蛋白變性失活的機(jī)率，因此溶液的pH值不能太低。由圖1可知，當(dāng)游離酶液的pH值小于6時(shí)，固定化酶活力較低，所以低聚果糖產(chǎn)率較低；當(dāng)pH值為6左右時(shí)，固定化效果較好；隨著pH值增加，樹脂的吸附能力有所下降，固定化效果不佳，導(dǎo)致低聚果糖產(chǎn)率有所降低。

圖1 pH值對固定化酶固定化效果的影響Fig.1 Effect of pH on the catalytic ability of immobilized β-fructofuranosidase

2.2 固定化時(shí)間對固定化效果的影響

在溫度25℃、pH6.5、游離酶酶活力800U/mL的條件下，考察固定化時(shí)間分別為2、3、4、5、6h時(shí)對固定化酶固定化效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 固定化時(shí)間對固定化酶固定化效果的影響Fig.2 Effect of immobilization time on the catalytic ability of immobilized β-fructofuranosidase

固定化時(shí)間對固定化效果和生產(chǎn)周期長短都有很大影響。由圖2可知，固定化時(shí)間在2～4h范圍內(nèi)時(shí)，低聚果糖產(chǎn)率隨著時(shí)間延長而增大，當(dāng)時(shí)間達(dá)到4h后，低聚果糖產(chǎn)率增幅趨于平緩，基本保持穩(wěn)定，從生產(chǎn)周期角度考慮，固定化時(shí)間不宜過長，選取4h左右。

2.3 游離酶液酶活力對固定化效果的影響

在溫度25℃、pH6.5、固定化時(shí)間5h的條件下，考察游離酶液酶活力分別為600、700、800、900、1000 U/mL時(shí)對固定化酶固定化效果的影響，結(jié)果見圖3。

固定化過程中由于受樹脂交換容量的影響，所使用的游離酶液酶活力對固定化結(jié)果有很大的影響。若酶液酶活力過低，固定化效果差；若酶活力過高，會造成酶蛋白的浪費(fèi)，增加成本，故應(yīng)選擇適宜的游離酶液酶活力。由圖3可知，當(dāng)游離酶液酶活力較低時(shí)，低聚果糖產(chǎn)率隨游離酶液酶活力升高而升高，在900U/mL時(shí)達(dá)到最大，此后，樹脂交換容量可能達(dá)到飽和，再提高游離酶液酶活力，對低聚果糖產(chǎn)率沒有明顯提高。

圖3 游離酶液酶活力對固定化效果的影響Fig.3 Effect of enzyme activity of free β-fructofuranosidase solution on the catalytic ability of immobilized β-fructofuranosidase

2.4 溫度對固定化效果的影響

在pH6.5，固定化時(shí)間5h，游離酶酶活力800U/mL的條件下，考察固定化溫度分別為20、25、30、35℃時(shí)對固定化效果的影響，結(jié)果見圖4。在30℃時(shí)固定化效果較好。因此酶的固定化選擇在30℃條件下進(jìn)行。

圖4 溫度對固定化效果的影響Fig.4 Effect of immobilization temperature on the catalytic ability of immobilized β-fructofuranosidase

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析結(jié)果Table 2 Response surface design layout and experimental results

根據(jù)表2結(jié)果，以低聚果糖產(chǎn)率為響應(yīng)值(Y)，用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多元回歸分析[17-20]，經(jīng)回歸擬合后，因素對響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示為：

圖5 游離酶液酶活力、時(shí)間(X1,X2)交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of enzyme activity of freeβ-fructofuranosidase solution and immobilization time

圖6 游離酶液酶活力、pH值(X1,X3)交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of enzyme activity of freeβ-fructofuranosidase solution and pH

圖7 時(shí)間、pH值(X2,X3)交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of pH and immobilization time

表3 回歸方程偏回歸系數(shù)的估計(jì)值Table 3 Estimated values of partial regression coefficients of the developed regression equation with the yield of fructooligosaccharides using immobilizedβ-fructofuranosidase as a function

表4 回歸方程方差分析表Table 4 Variance analysis for the developed regression equation

根據(jù)回歸方程作出響應(yīng)面圖及等高線圖，由圖5～7可直觀地看出各因子對響應(yīng)值的影響變化趨勢，而且回歸模型存在最大值。再對回歸方程進(jìn)行方差分析及偏回歸系數(shù)的估計(jì)。從表3、4可以看出，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，其因變量和自變量之間的線性關(guān)系是顯著的，決定系數(shù)為93.51%，說明回歸方程的擬合程度很好，不存在模型擬合不足的現(xiàn)象，因此該響應(yīng)面能夠真實(shí)地反映數(shù)據(jù)結(jié)果。

2.5.2 尋求最優(yōu)值

利用SAS軟件進(jìn)行嶺脊分析[21-23]以確定各因素的最佳取值。通過分析可以得到回歸模型的最大值點(diǎn)，該點(diǎn)(X1、X2、X3)的代碼值為(－0.061932、0.093718、0.222773)，與之對應(yīng)的實(shí)際值為X1=893.81U/mL，X2=4.09h，X3=6.61，低聚果糖理論最大產(chǎn)率為58.80%。考慮到實(shí)際操作的便利，確定最佳固定化條件：游離酶液酶活力900U/mL、時(shí)間4h、pH6.6。

2.5.3 方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

在上述優(yōu)化條件下共進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，低聚果糖產(chǎn)率分別為58.69%、57.51%、58.27%，平均產(chǎn)率為58.16%，RSD為1.03%，結(jié)果與預(yù)測值58.80%是非常接近的。

3 結(jié) 論

以大孔徑陰離子樹脂D311為固定化β-D-呋喃果糖苷酶的載體，對其固定化條件進(jìn)行研究，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)曲面分析法對其固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，從而確定最佳固定化條件為：固定化時(shí)間4h、游離酶液酶活力900U/mL、pH值為6.6。在此優(yōu)化條件下，用固定化β-D-呋喃果糖苷酶進(jìn)行低聚果糖生產(chǎn)，產(chǎn)率可達(dá)到58.16%，經(jīng)驗(yàn)證RSD為1.03%，說明該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可行。

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Optimization of Ion Exchange Immobilization of β-Fructofuranosidase Using Response Surface Methodology

ZHANG Yuan-yuan，NIE Shao-ping，WAN Cheng，XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

D311 type macroporous anion exchange resin was used as a carrier for the immobilization of β-fructofuranosidase derived from Aspergillus japonicus. The effects of immobilization time and temperature, pH and enzyme activity of free β-fructofuranosidase solution on the catalytic ability of immobilized β-fructofuranosidase were investigated by single factor method and based on this, except immobilization temperature, three other conditions were optimized using response surface methodology. The optimum immobilization conditions were determined as follows: enzyme activity of free β-fructofuranosidase solution 900 U/mL and pH 6.6 for 4 h immobilization at room temperature, and the yield of fructooligosaccharides using immobilized β-fructofuranosidase under these conditions was 58.16%.

β-fructofuranosidase；ion exchange adsorption；immobilization；response surface methodology (RSM)

Q814.2

A

1002-6630(2010)19-0236-05

2010-05-04

教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”項(xiàng)目(IRT0540)；食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向資助項(xiàng)目(SKLF-MB-200806)

張媛媛(1983—)，女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：zhyy2009@yahoo.com.cn

*通信作者：謝明勇(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)、食品營養(yǎng)與安全及天然產(chǎn)物分離與應(yīng)用。E-mail：myxie@ncu.edu.cn