反相高效液相色譜法測(cè)定青蒿中青蒿酸的含量

孫景燦,曾建立,趙 兵,袁曉凡,王曉東

1中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190;2中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京 100049

反相高效液相色譜法測(cè)定青蒿中青蒿酸的含量

孫景燦1,2,曾建立1,2,趙 兵1＊,袁曉凡1,王曉東1

1中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190;2中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京 100049

本文建立了反相高效液相色譜快速測(cè)定青蒿中青蒿酸含量的方法。色譜條件為:Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm,5μm),柱溫為 (30±1)℃,流動(dòng)相采用乙腈與 0.2%磷酸水溶液混合液 (體積比 65:35),流速 1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng) 220 nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y=8.784573×10-8X-6.443559×10-5,r=0.9997,青蒿酸回收率為 102.4%。實(shí)驗(yàn)證明該方法穩(wěn)定可靠、精密度高、重現(xiàn)性好、簡(jiǎn)單可行,適用于青蒿酸的分析檢測(cè)。

青蒿;青蒿素;前體;青蒿酸;反相高效液相色譜

從青蒿 (Artem isia annuaL.)中提取分離的青蒿素作為最有效的抗瘧藥物已得到世界公認(rèn),而且隨著青蒿素新用途的不斷發(fā)現(xiàn),其資源需求量將越來(lái)越大,但不少青蒿中青蒿素含量低 (≤0.3%),無(wú)法用于提取青蒿素。研究發(fā)現(xiàn)青蒿中青蒿素含量和青蒿酸含量呈相反規(guī)律,如山西廣靈產(chǎn)的青蒿中青蒿素含量為 0.1%左右,而青蒿酸的含量達(dá)到 0.5%,是青蒿素含量的 5倍[1]。青蒿酸 (Artemisinic acid)最早是由中科院上海藥物所鄧定安等從山東產(chǎn)青蒿丙酮提取物中分離得到,并分析了其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[2]。青蒿酸是一種倍半萜類化合物,無(wú)色方形晶體,分子式為 C15H22O2,分子中含有一個(gè)羧基,顯弱酸性,能溶于NaHCO3溶液和石油醚、丙酮及醇類等有機(jī)溶劑[2,3]。在青蒿素合成代謝途徑中,青蒿酸是青蒿素合成的重要前體物質(zhì)之一[4,5]。雖然青蒿酸也具有一定的抗瘧疾活性,但其活性遠(yuǎn)低于青蒿素[6],因此青蒿酸的利用一直未能引起重視。青蒿酸不僅可以作為青蒿素合成前體,還具有抗腫瘤等多種活性[7],我國(guó)低青蒿素含量的青蒿資源分布廣泛、產(chǎn)量巨大,具有青蒿酸生產(chǎn)的原料優(yōu)勢(shì)。

在青蒿酸提取、分離和轉(zhuǎn)化成青蒿素的過(guò)程中,需要對(duì)青蒿酸含量變化進(jìn)行準(zhǔn)確和快速的檢測(cè)。目前有關(guān)青蒿酸的分析檢測(cè)都是以青蒿素為主要分析對(duì)象的前提下進(jìn)行,而青蒿酸與青蒿素同時(shí)檢測(cè)時(shí),需要采用特殊的檢測(cè)器,分析時(shí)間大大延長(zhǎng)。如在HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS同時(shí)分析檢測(cè)青蒿素、青蒿酸和青蒿乙素的方法中,就需要使用電噴射電離-四極時(shí)間飛行器與質(zhì)譜進(jìn)行樣品處理和檢測(cè),分析過(guò)程復(fù)雜[8],在 HPLC-UV-ELSD的檢測(cè)方法中需同時(shí)使用紫外和蒸發(fā)光散射兩種檢測(cè)器,分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá) 40 min左右[1]。因此,研究建立青蒿酸快速準(zhǔn)確檢測(cè)方法對(duì)低青蒿素含量青蒿資源的利用和青蒿酸的開(kāi)發(fā)均具有重要意義。

本文針對(duì)青蒿酸建立了 RP-HPLC-UV的分析檢測(cè)方法,該方法不需要特殊的設(shè)備,而且分析方法穩(wěn)定性好、精密度高、時(shí)間短、過(guò)程簡(jiǎn)單,可以作為青蒿酸定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津LC-20 AT高效液相色譜儀 (日本島津公司),包括 SPD-M20A二級(jí)管陣列檢測(cè)器、S IL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、LCsolution液相色譜工作站;8002型恒溫水浴控制器(余姚明偉儀表廠);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);TDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試劑與藥品

不同產(chǎn)地青蒿、青蒿酸對(duì)照品 (中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,純度 98%);乙腈 (Fisher公司)、無(wú)水甲醇 (Fisher公司)為色譜純;磷酸 (北京化學(xué)試劑公司)、無(wú)水乙醇 (天津市福晨化學(xué)試劑廠)均為分析純。

1.3 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱 (250 mm ×460 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈和 0.2%磷酸水溶液,等梯度洗脫,兩相體積比為 65:35,分析時(shí)間為 25 min,流速為 1 mL/min,進(jìn)樣量為 10μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為 220 nm,柱溫為 (30±1)℃。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取青蒿酸對(duì)照品 3.25 mg,用無(wú)水甲醇溶解并定容至 50 mL,得到濃度為 0.0650 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。在 2.3所述色譜條件下分析得到青蒿酸對(duì)照品的 HPLC色譜圖如圖 1所示,青蒿酸保留時(shí)間為 20.56 min。

圖 1 青蒿酸對(duì)照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of artemisinic acid reference substance

1.5 樣品制備

取 1 g粒度為 80目的青蒿原料,放于 100 mL具塞三角瓶中,加入 50 mL無(wú)水乙醇浸泡 1 h,超聲提取 3次,每次 30 min,離心取上清得到青蒿提取液。進(jìn)樣前用 0.22μm的微孔膜過(guò)濾,按 2.3所述HPLC色譜條件分析,色譜圖如圖 2所示,樣品溶液中的青蒿酸出峰時(shí)間 20.60 min,與圖 1中青蒿酸對(duì)照品出峰時(shí)間一致。

圖 2 青蒿酸樣品溶液 HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of artemisinic acid sample solution

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

圖 3是青蒿酸對(duì)照品在 190～400 nm之間的全波長(zhǎng)掃描圖,由圖可知青蒿酸在 195 nm處有最大紫外吸收。在這個(gè)波長(zhǎng)下,洗脫劑中乙腈和甲醇的吸收也很強(qiáng)(乙腈的最大吸收波長(zhǎng) 190 nm,甲醇為 205 nm),如果波長(zhǎng)選定為195 nm,洗脫劑的會(huì)對(duì)青蒿酸檢測(cè)產(chǎn)生影響;但是乙腈和甲醇在 220 nm處紫外吸收較弱,而青蒿酸在 220 nm下的吸收較強(qiáng),所以選擇 220 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖 3 青蒿酸對(duì)照品在 190～400 nm間的紫外吸收光譜圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectrogram (190-400 nm)of artemisinic acid reference substance

2.2 流動(dòng)相選擇

與甲醇相比,乙腈對(duì)青蒿酸的洗脫能力更強(qiáng),與水混合后產(chǎn)生的柱壓也更低,所以選擇乙腈為洗脫溶劑。但是僅使用乙腈與水的混合液為洗脫溶劑時(shí),色譜峰有拖尾現(xiàn)象,為改良峰形,避免拖尾,選擇0.2%磷酸水溶液作為洗脫緩沖溶液。

圖 4為不同流動(dòng)相配比條件下的色譜圖,A、B、C、D中上部分為青蒿酸對(duì)照品的色譜圖,下部分為提取液樣品的色譜圖。如圖所示,當(dāng)乙腈-磷酸緩沖溶液配比為 55∶45和 60∶40時(shí),目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰可以分開(kāi),但峰的純度較低,且保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng) (圖 4A、4B);提高有機(jī)相濃度可縮短保留時(shí)間,當(dāng)乙腈-磷酸緩沖溶液配比調(diào)整為 70∶30時(shí),洗脫能力較強(qiáng),保留時(shí)間縮短,但是青蒿酸與其他雜質(zhì)的峰重合,無(wú)法分開(kāi)(圖 4C);進(jìn)一步調(diào)整乙腈-磷酸緩沖溶液配比為 65∶35時(shí),目標(biāo)物質(zhì)峰可與雜質(zhì)峰分開(kāi),峰形較好,純度較高,且出峰較快 (見(jiàn)圖 4D),故選擇洗脫溶劑配比為 65∶35。

圖 4 不同流動(dòng)相配比條件下青蒿酸對(duì)照品溶液和樣品溶液色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of artemisinic acid reference substance solution and sample solution with different mobile phase ratios

2.3 流速選擇

圖 5是樣品在不同洗脫流速(A、B、C、D依次為0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min)下的色譜圖。當(dāng)流速為0.6 mL/min和 0.8 mL/min時(shí),保留時(shí)間分別為 35. 94 min(5A)和 25.84 min;提高流速,可以縮短分析時(shí)間,當(dāng)流速提高到 1.2 mL/min時(shí),青蒿酸在 17. 40 min即可出峰(5D),但是此時(shí),柱壓升高,會(huì)影響色譜柱壽命;綜合考慮 1.0 mL/min(5C)的流速比較適宜,出峰較快,峰形也好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限的測(cè)定

分別取 2.4中所制備的青蒿酸對(duì)照品溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL加入 5 mL容量瓶定容,得到青蒿酸濃度分別為 0.0026、0.0078、0.0130、0.0182、0.0234 mg/mL的 5個(gè)對(duì)照品溶液。進(jìn)樣10 μL進(jìn)行檢測(cè),記錄數(shù)據(jù)并以峰面積為(X)為橫坐標(biāo),樣品濃度 (Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖 6所示?；貧w方程為Y=8.784573×10-8X-6.443559 ×10-5,相關(guān)系數(shù)r=0.9997。最低檢出限為 1.7 μg/mL(S/N=3)。

圖 5 青蒿酸樣品溶液在不同洗脫劑流速下的色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of artemisinic acid sample solution in different flow rates

圖 6 青蒿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Calibration curve of artemisinic acid

2.5 穩(wěn)定性的測(cè)定

取濃度為 0.0338 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,每 2 h測(cè)一次,12次測(cè)定峰面積結(jié)果見(jiàn)表 1,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為RSD=0.25%,表明該方法在 24 h內(nèi)穩(wěn)定性。

2.6 精密度的測(cè)定

取濃度為 0.0338 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)檢測(cè) 5次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2,峰面積 RS D值為 0.28%,保留時(shí)間的RS D值為0.26%,表明該方法檢測(cè)精密度較高。

2.7 重現(xiàn)性的測(cè)定

按照 2.5中所述方法制備 5份供試液,分別在同樣的色譜條件下測(cè)定青蒿酸含量,分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表3,計(jì)算 RSD值為 1.96%,表明該方法重現(xiàn)性較好。

表 1 檢測(cè)方法穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 1 Test data of the detection method’s stability

表 2 檢測(cè)方法精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 2 Test data of the detection method’s precision

表 5 不同產(chǎn)地青蒿中青蒿酸的含量Table 5 Artemisinic acid content inA rtem isia annuaL.grown in different places

表 3 檢測(cè)方法重現(xiàn)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 3 Test data of the detection method’s repeatability

2.8 加標(biāo)回收率的測(cè)定

精確稱取同一批已知青蒿酸含量的樣品 0.05 g,共 6份,加入適量濃度為 0.6055 mg/mL的對(duì)照品溶液,按照 2.5中制備樣品溶液的方法進(jìn)行提取準(zhǔn)備待測(cè)液,按照上述色譜分析方法分析檢測(cè),計(jì)算回收率(表 4),RSD為 1.97%(n=6)。

表 4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)Table 4 Standard addition recovery test

2.9 樣品的測(cè)定

分別以貴州遵義、重慶酉陽(yáng)以及湖南三個(gè)產(chǎn)地的青蒿為原料,按照 2.5所述方法制備青蒿酸樣品溶液,采用上述反相高效液相色譜方法進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表 5,5個(gè)樣品中青蒿酸含量最高可達(dá)到1.4 mg/g,可以用來(lái)生產(chǎn)青蒿酸從而充分利用青蒿資源。

3 總結(jié)

本文建立了反相高效液相色譜檢測(cè)青蒿酸的方法,選擇反相 C18柱,以乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相(體積比 65∶35),在 30℃的溫度下于 220 nm處檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明:該方法具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及精密度,青蒿酸保留時(shí)間顯著縮短,可以用于青蒿中青蒿酸的快速檢測(cè)。

青蒿酸具有重要研究開(kāi)發(fā)價(jià)值,用于青蒿酸提取的青蒿資源豐富。本文建立的反相高效液相色譜法可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)青蒿酸含量,可以為青蒿資源有效利用和青蒿酸研究開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 ZhangD(張東),YangL(楊嵐),YangLX(楊立新),et al. Determination of artemisinin,arteannuin B and artemisinic acid in herbaA rtem isiae annuaeby HPLC-UV-ELSD.Acta Phar m Sin(藥學(xué)學(xué)報(bào)),2007,42:978-981.

2 DengDA(鄧定安),Zhu DY(朱大元),Gao YL(高耀良),et al.Study on the structure of Artemisinic acid.Chin Sci Bull(科學(xué)通報(bào)),1981,19:1209-1211.

3 Misra LN,Ahmad A,Thakur RS,et al.Crastal structure of artemisinic acid:A possible biogenetic precursor of antimalarial artemisinin fromA rtem isia annua.J Nat Prod,1993, 56:215-219.

4 Jung M,Elsohly HN,Mc Chesney JD.Artemisinic acid: averstile chirasython and bioprecursor to natural products.Planta M ed,1990,56:624-626.

5 Browna GD,Syb LK.In vivotransformations of artemisinic acid inA rtem isia annuaplants.Tetrahedron,2007,63:9548-9566.

6 Zhou S W(周生偉),Wang SL(王莎莉),Wang YP(王亞平).Inhibitory effects of artemisinic acid on proliferation of K562 cellsin vitro.J Chongqing M ed Univ(重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)),2006,31:159-162.

7 SunWC(孫瑋辰),Han JX(韓家嫻),YangWY(揚(yáng)蔚怡),et al.Antitumor activities of 4 derivatives of artemisinic acid and artemisinin Bin vitro.Acta Phar m Sin(中國(guó)藥理學(xué)報(bào)),1992,13:541-543.

8 Filip CW,Nieuwerburgh V,Sofie RF,et al.Quantitation of artemisinin and its biosynthetic precursors inA rtem isia annuaL.by high perfor mance liquid chromatography– electrospray quadrupole t ime-of-flight tandem mass spectrometry.J ChromatogrA,2006,1118:180-187.

Determ ination of Artem isin ic acid inA rtem isia annuaL.by RP-HPLC

SUN Jing-can1,2,ZENG Jian-li1,2,ZHAO Bing1＊,YUAN Xiao-fan1,WANG Xiao-dong1

1National Key laboratory of B iochem ical Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China;2Graduate University of Chinese Academ y of Sciences,Beijing 100049,China

A method for detecting the content of artemisinic acid which is the key precursor of artemisinin inA rtem isia annuaL.by RP-HPLC was established.Itwas carried out in a Diamonsil C18column(250 mm ×4.6 mm,5μm)at (30±1)℃.Acetonitrile combinedwith 0.2%phosphoric acid aqueous solution(65:35,V/V)was used as the mobile phase at a flow rate of 1 mL/min,and the detection wavelength was 220 nm.The calibration curve equation wasY= 8.784573×10-8X-6.443559×10-5(r=0.9997).A recovery rate of 102.4%was achieved.The results proved that thismethed was suitable for detecting artemisinic acid with good stability,high precision,strong reproducibility,and simple operation.

A rtem isia annuaL.;artemisinin;precursor;artemisinic acid;RP-HPLC

R284.1;Q946.91

A

1001-6880(2010)05-0846-05

2009-01-09 接受日期:2009-03-18

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)基金 (2007AA021501)

＊通訊作者 Tel:86-10-82627059;E-mail:bzhao@home.ipe.ac.cn